题目：浓缩果汁中耐热菌双夹心ELISA检测方法的标准化及应用研究

酸土环脂芽孢杆菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，即耐热菌，生产上常称之为TAB（Thermophilic acidophilic bacteria）。在温度过高时或者环境恶劣不适应于其生长时可以形成芽孢，巴氏杀菌过程不能杀死耐热菌，常以芽孢的形式存在于果汁中，芽孢在极低浓度的时候也可以在果汁贮藏和销售过程中繁殖而导致果汁酸败，因此耐热菌成为引起浓缩苹果汁变质的主要微生物之一，也是浓缩苹果汁生产中重要的目标控制微生物。
为了有效地控制耐热菌，最重要的一点就是首先快速准确的检测出浓缩果汁中耐热菌的有无。当前使用最多的耐热菌检测方法为美国库克实验室的经典KFL平板培养计数法，需要耗费4~5日的时间。检测结果不能满足生产需要，不能及时检测出果汁中是否含有耐热菌以预告工业生产采取防范控制措施。
本课题在本实验室已建立的果汁中耐热菌双夹心ELISA检测方法的基础上通过耳缘静脉注射免疫大耳白兔制备获得了耐热菌兔源多克隆抗体，通过肌肉注射免疫SD大鼠制备获得了耐热菌鼠源多克隆抗体。采用盐析、蛋白A / 蛋白G亲和层析、透析、浓缩等方法分离纯化获得了耐热菌兔源抗体IgA和鼠源多克隆抗体IgG；并通过SDS-PAGE表明抗体具有很高的纯度，通过ELISA特异性检测表明纯化获得的两种抗体与常见食源微生物无交叉反应，通过ELISA测定耐热菌兔源多克隆抗体IgA和鼠源多克隆抗体IgG效价分别高达1:25600和1:12800。并对该方法做出了完善的标准规范，进一步优化了耐热菌双夹心ELISA检测方法中的一些重要的反应步骤：最佳包被条件为37℃、2h；最佳封闭液为5%明胶溶液；最佳封闭时间为2h；一抗与抗原最佳反应时间为1h；二抗与抗原最佳反应时间为1h；酶标二抗与二抗结合时间为1h。
在实验室的基础上制作出了试剂盒，完善了试剂盒的制备方法与使用方法。将制备出的试剂盒用于果汁样品的检测，同时采用经典计数KFL方法检测果汁样品，所得结果与经典平板培养计数KFL方法作出比较，结果可信。本研究还在试剂盒建立的基础上初步研究试剂盒生产产业化探究以及试剂盒实际应用的初步研究。