● 摘要
绿蛙(Rana clamitans)属两栖纲(Amphibia)、无尾目(Anura)、蛙科(Ranidae)、蛙属(Rana)，是一种常见水栖动物，其胚胎和幼体发育均在水中进行，其原产地是美国，目前中国多个省份都有引进的绿蛙，且数量较多。本研究以绿蛙的蝌蚪组织为材料，采用透射电子显微镜和DNA末端限制性长度多态性(Terminal-restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)等技术，研究绿蛙幼体蝌蚪消化道中肠超微结构及其消化道微生物群落多样性的特征，并发现500 mg/L氯化钠对绿蛙幼体消化道及其微生物群落特征的研究结果有显著的改变作用。主要研究成果如下：
1. 利用透射式电子显微镜观察蝌蚪消化道中肠的超微结构。结果显示，正常蝌蚪的中肠肠道的结构分为粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜四部分；粘膜层上皮主要以上皮吸收细胞为主，细胞表面有微绒毛，细胞间连接不是很紧密，细胞间隙较大且不规则，有少量的杯状细胞分散在粘膜层上皮的吸收细胞之间；在吸收细胞内可以观察到大量整齐排列的线粒体、核糖体、盘旋折叠的内质网和少量的脂滴；肌层不发达，可以清楚看到二层内环肌和一层外纵肌。
2. 通过实验发现，当将蝌蚪暴露于500 mg/L氯化钠中，利用透射式电子显微镜观察中肠超微结构的发生改变。氯化钠处理使得蝌蚪消化道中肠粘膜层上皮的吸收细胞体积缩小，细胞发生固缩；细胞质内线粒体和游离核糖体的数目明显下降；脂滴数目显著增加，且在脂滴附近出现过氧化物酶体。说明氯化钠对绿蛙蝌蚪中肠细胞造成了明显损伤，表明两栖类对氯化钠的耐受性很低。
3. 利用DNA的T-RFLP技术研究绿蛙蝌蚪消化道微生物群落的生物多样性特征，结果显示，用HindP1I、HaeIII、AluI和MspI四种不同内切酶处理16s rDNA后，检测到的T-RF的数目结果各不相同，不同的T-RF代表不同的菌落。不同的氯化钠环境对绿蛙蝌蚪消化道微生物群落的生物多样性的测试效果有明显的影响。在不外加氯化钠的对照组蝌蚪实验中，用内切酶HaeIII处理其DNA后，检测出的T-RF数目最多，用内切酶 MspI处理其DNA后，检测出的T-RF数目最少。在500mg/L的氯化钠处理蝌蚪的组中，做同样的DNA处理实验，结果显示MspI组检测出的T-RF数目最多，AluI组检测出的T-RF数目最少。说明T-RFLP的实验环境氯化钠对绿蛙蝌蚪消化道微生物菌群多样性的研究结果有明显的差别和影响。
4. 进一步研究还发现氯化钠对绿蛙蝌蚪消化道微生物群落的组成及丰度的变化有明显的影响。用HaeIII酶切处理后，氯化钠组T-RF15的相对含量显著减少；用HindP1I酶切处理后，氯化钠组T-RF92和T-RF117相对含量显著下降；AluI酶切后，氯化钠组T-RF53和T-RF97的相对含量显著下降；MspI酶切后，氯化钠组的T-RF97和T-RF117显著下降，说明这些菌群均对氯化钠比较敏感。HaeIII酶切后，氯化钠组T-RF293的相对含量显著增加；AluI酶切后，氯化钠组T-RF72相对含量显著增加；MspI酶切后，氯化钠组的T-RF90和T-RF71相对含量显著增加，说明这些菌群均对氯化钠比较耐受。除此之外，还有新增和消失的T-RF片段，说明氯化钠能使蝌蚪消化道微生物群落的组成和丰度发生改变。
5. 利用蓝白斑筛选技术研究了绿蛙蝌蚪消化道中微生物菌落的种类组成，结果显示，蝌蚪消化道微生物菌群主要分属于紫单胞菌属(Paludibacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)和希瓦氏菌属(Shewanella)。而且发现氯化钠对泥杆菌属与紫单胞菌属微生物的生长有明显的抑制作用，但对梭杆菌属和希瓦氏菌有促进生长的作用。
上述结果表明，500 mg/L 氯化钠有助于蝌蚪肠道亚显微结构的观察和微生物群落种类的检测，但发现早期绿蛙蝌蚪对氯化钠十分敏感，具有一定的毒性作用。通过对绿蛙幼体蝌蚪消化道中肠超微结构及其消化道微生物群落多样性的特征进行研究，为进一步研究两栖类不同发育时期的微生物多样性特征研究及水生野生动物保护提供实验参照和理论依据。