● 摘要
抗生素滥用导致了全球性的细菌耐药问题，随着弊端一一显现，人们希冀于研发出不会引起细菌耐药的抗菌药物。抗菌肽一直被认为是未来可以替代抗生素的新型抗菌制剂，而蛙类动物因其在长期自然进化中形成了可大量分泌抗菌肽的皮肤腺体，成为了抗菌肽资源的天然宝库；且蛙抗菌肽通常有分子量小、抑菌活性好、溶血性低等特别，是抗菌肽研究中的热点。但越来越多的实验表明经过长期的协同进化，病原微生物也能够进化出一定的抗性机制对抗抗菌肽，探究这些抗性的产生过程对解决抗菌肽耐药性问题是极有必要的。
Brevinin-2CE是本实验室于中国林蛙中克隆得到的抗菌肽基因，其编码的抗菌肽Brevinin-2CE具有出色的广谱抑菌活性，是一种典型的阳离子抗菌肽，它能与病原菌细胞膜相结合后使其破裂，导致内溶物外泻最终细菌死亡。本实验以人工合成的Brevinin-2CE作为研究材料，用非致死浓度短时作用于大肠杆菌，分别用消减杂交、转录组测序、实时定量PCR技术检测实验组与对照组之间的基因表达差异，旨在研究大肠杆菌在抗菌肽处理初期转录组水平的变化，预测菌体可能在哪些方面产生应激反应。随后，克隆检测出的两个表达差异基因cspB（实验组中表格水平上调），srlE（实验组中表达水平下调），并分别连接到pET-28a质粒构建成为原核表达载体，转化进大肠杆菌中，通过检测转化菌对各抑菌物质的敏感度推测这两个基因参与细菌抑菌的功能。
本研究中，通过消减杂交筛选到了10个，通过转录组测序筛选到了37个出现显著表达变化的基因，根据功能、表达差异的显著性等参数选择了其中的20个经过实时定量PCR再次验证，最终得到11个基因。总结发现，上调的基因涵盖冷应激、多药外排泵、细胞壁合成、核糖体结构等多方面，而下调的两个基因与膜透性、渗透压相关。这些基因的表达变化大多都与Brevinin-2CE的杀菌机制有关，如合成细胞壁的mraY，murE基因、参与代谢的frdD，uhpA，uhpB上调可认为是细胞膜破裂后机体的急救措施，多药外排泵基因sugE上调可有助于将进入细胞的抗菌肽排出胞外，cspB和cspE基因已被证实在过表达时有助于细菌抵御抗菌肽，而编码山梨醇特异透性酶的srlE，参与压力响应调控的uspA 出现下调应是胞内外渗透压失衡引发的。在实验过程中还发现，16S rRNA作为大肠杆菌的首选内参，向来对各种刺激都能维持稳定表达量，但却在Brevinin-2CE处理后有了显著的表达上调，这与转录组测序结果中多个编码核糖体亚基的基因上调相印证，共同说明在Brevinin-2CE处理初期大肠杆菌的核糖体合成水平大幅度提高。
在基因功能检测实验中，分别成功构建了cspB和srlE基因的原核表达载体，并分别转化进大肠杆菌（菌株编号A70），得到了A70-pET-28a[cspB]、A70-pET-28a[srlE]两个菌株。在抑菌实验中以A70-pET-28a和野生菌A70作为对照，用不同浓度的Brevinin-2CE、氨苄青霉素和利福平进行抑菌率检测，发现A70-pET-28a[cspB]对Brevinin-2CE、氨苄青霉素、利福平的MIC值均无变化，且在各浓度时的抑菌率也无明显差别，A70-pET-28a[srlE]对Brevinin-2CE、利福平的敏感度也无差别，但却对低浓度的氨苄青霉素抗性明显降低。