题目：中华大蟾蜍胚胎发育中脱碘酶基因DIO2、DIO3表达特性的研究

甲状腺是脊椎动物体内非常重要的内分泌腺，通过分泌甲状腺激素（T3、T4）来调控机体的氮平衡、脂降解等代谢过程，在脊椎动物的生长、发育以及变态过程中发挥着重要作用。甲状腺滤泡为球状结构，是甲状腺的基本功能单位，甲状腺激素的合成所需底物由甲状腺滤泡中的胶质提供。滤泡中胶质的变化常用于评估无尾两栖类发育及变态过程中甲状腺合成甲状腺激素的机能。
甲状腺激素的活化及失活过程由脱碘酶催化实现。II型脱碘酶（D2）通过催化外环脱碘过程（ORD）使T4活化为T3；III型脱碘酶则具有内环脱碘作用（IRD），使T3及T4降解失活；I型脱碘酶（D1）同时具有内环及外环脱碘能力。在无尾两栖类变态发育过程中，D2及D3在启动组织重构及调控细胞应答方面发挥重要作用。本实验以中华大蟾蜍蝌蚪为研究材料，采用组织学方法，对甲状腺的出现以及具有功能的时期进行研究；采用整体原位杂交及石蜡切片原位杂交技术，检测了D2基因（DIO2）以及D3基因（DIO3）的mRNA在不同发育时期的中华大蟾蜍胚胎中的表达差异；采用RT-PCR及Real-time PCR方法，对不同发育时期中华大蟾蜍样本中DIO2 mRNA及 DIO3 mRNA水平进行相对定量研究。本文的主要研究结果如下：
1. G38期中华蟾蜍蝌蚪甲状腺的解剖学观察结果显示，甲状腺位于心脏的背侧，关联骨Ⅱ的腹后侧，腮下骨板的腹侧前端，介于两条颏舌骨肌之间，左右侧各一个。甲状腺有若干透明的甲状腺滤泡聚集。甲状腺滤泡上皮细胞包绕形成透明的甲状腺滤泡腔。
2. G25期（变态前期）的中华大蟾蜍样本体内未观察到甲状腺。G28期（变态前期）中华大蟾蜍蝌蚪已经形成甲状腺。此时甲状腺较小，滤泡数目少，并且滤泡中无胶质。G33期（临近变态期）中华大蟾蜍蝌蚪滤泡数目增加，可见立方形的甲状腺滤泡细胞，滤泡腔中具有胶质并均一。该结果意味着中华大蟾蜍甲状腺最早出现在变态前期，而甲状腺在临近变态期时才具有合成甲状腺激素的功能。
3. 原位杂交结果显示DIO2基因的杂交信号最早出现于G6期胚胎的动物半球；G8及G9期胚胎中DIO2基因的表达仍局限于动物半球；胚胎发育至G14期时，DIO2基因杂交信号主要集中在神经褶、鳃板原基及预定黏附腺；发育至G17期时，胚胎的中脑、眼泡、黏附腺、体节及尾芽等部位均有DIO2 mRNA阳性反应；发育至G20期时，DIO2 mRNA主要分布于后脑、鼻、口器、咽、鳃、黏附腺、脊髓、体节及尾等部位；发育至G23期时，阳性反应主要分布在耳泡、鼻、口器、咽、鳃、黏附腺、脊髓、体节及尾等部位，在脑部未检测到阳性信号；发育至G26期时，蝌蚪的耳泡、内鳃及体节处均有DIO2表达，并且在眼、肝脏及肠道等部位也检测到了DIO2 mRNA阳性信号。
早于G6期的胚胎中未检测到DIO3基因的表达；在G6、G8及G9期胚胎动物半球可检测到微弱的阳性反应；胚胎发育至G14期时，DIO3基因杂交信号主要集中鳃板原基区域；发育至G17期时，胚胎的眼、耳泡、鳃、黏附腺、体节及尾芽等部位均有位均有DIO3 表达；发育至G20期时，阳性反应主要分布在前脑、鳃、口器、黏附腺、脊髓、体节及尾等部位；发育至G23期时，DIO3表达主要分布于眼、体节、尾、鳃、口器、黏附腺、耳泡等部位，在脑部未检测到阳性信号；发育至G26期时，在蝌蚪的耳泡、眼、内鳃、体节、肝脏及肠道等部位也检测到了DIO3 mRNA阳性信号。
4. 中华大蟾蜍DIO2 mRNA及DIO3 mRNA在卵中已经开始表达。胚胎发育过程中，DIO2及DIO3的表达早在G1期（受精卵期）已经开始，在G14期（神经褶期）表达量最高。我们推断DIO2及DIO3可能在神经发育中发挥一定作用。
G23期至G42期整体蝌蚪DIO2 mRNA水平呈上升趋势，于G42期（变态高峰期）达到最大值。DIO3 mRNA的表达量在G23期至G38期逐渐上升，在G38期（临近变态期）的蝌蚪体内表达量最高。推测DIO3 mRNA表达量的增加可能与D3在临近变态期对部分组织的保护作用有关，而DIO3 mRNA表达量降低恰与变态后期部分器官发育的启动同步。