题目：发光分析新方法的研究

　　酶是一种高效、专一的生物活性物质，它是构成生命活动的最重要的因素。碱性磷酸酶（ALP）是一种在碱性条件下能催化磷酸酯类水解的酶，它广泛存在于人体各组织器官中，当人体组织发生病变时，就会引起（ALP）活力异常，某些杀虫剂也会造成人体ALP活力的变化，所以ALP活性测定在临床检验和卫生保健上都有非常重要的意义。ALP 因其稳定性好、分子量小、活性高、宜分离提纯等优点，以广泛的被用作酶联免疫分析分析和DNA杂交分析的标记物，通过分析测定ALP的活性从而间接的分析测定DNA、RNA、抗原、抗体、等生物大分子。基于这两方面的需要，从而也促进了ALP活力测定方法的研究和发展。在人们研究的各种测定方法中，主要有比色法，荧光法和化学发光法三大类。本文在第一部分碱性磷酸酶活性的测定的综述中，详细介绍了这三种方法，并对这三种方法的优缺点进行了比较、评述。综述中重点介绍了当前最先进的测定ALP的几种方法，有时间分辨荧光法，有以AMPPD为化学发光底物的化学发光法，有操作简单，灵敏度高的以BCIP/NBT为底物的比色法，结合化学发光法还介绍了最新的类似于放射自显影技术。最后介绍了ALP作为标记物在酶联免疫分析和DNA杂交分析中的新的应用。 　　本文的第二部分为研究报告，分四个独立的内容。 　　第一为荧光法测定碱性磷酸酶的活性。荧光法因起灵敏度高至今仍是测定酶活性的有效分析手段。研究过的ALP荧光底物已不少，4-甲基伞形酮磷酸酯因其稳定性好，酶促水解速度快，水解产物4-甲基伞形酮的量子产率高，被认为荧光法测ALP活性的理想底物。本文报道了4-甲基伞形酮合成4-甲基伞形酮磷酸酯的方法，并将合成物作为ALP的荧光底物，用荧光法成功的测定了ALP及HuIgG-ALP的活性，ALP的线性范围为6.8×10ˉ（-8）─1.7×10ˉ（-5）IU/ml,绝对检出限为9.35×10（-8）IU, HuIgG-ALP的线性范围为1.7×10ˉ（-5）─1.7×10ˉ（-8） IU/ml,检出限为4.0×10ˉ（-9） IU/ml，反应液总体积仅为1ml，此法灵敏度高，操作简便、快速、试剂用量少，可用于临床样品的ALP活性测定，也可用于以ALP为标记物的酶联免疫分析和DNA杂交分析。 　　第二为以DEAE Sephadex 为基质铝荧光传感器层的研究。首次报道了一个基于荧光猝灭的ALˉ（3+）传感层，它是基于电价键固定在DEAE Sephade×上的水扬基荧光酮，与溶液中的ALˉ（3+）反应导致荧光猝灭的原理设计的。该传感层不仅固定方法简单，而且响应可逆、快速、灵敏度高，其线性范围为20ng/ml ─150ng/ml,该传感层已成功应用于水样和葡萄糖注射液中ALˉ（3+）离子的测定。并初步研究了荧光猝灭机理。 　　第三为4-甲基伞形酮荧光猝灭法测定苦味酸。报道了一种新的测定苦味酸的荧光光度法，它是基于苦味酸对4-甲基伞形酮荧光的猝灭。与萃取分光光度法和气象色谱法相比，本发生率了萃取步骤，且灵敏度较高，线性范围宽，操作简便，干扰少。其检出限可达8×10ˉ（-7）mol·L-1在1×10ˉ（-6）─1×10ˉ（-4） mol·Lˉ（-1）范围内，与苦味酸浓度呈良好的线性关系。成功用于复方奎宁注射液中奎宁的见解测定和水样中苦味酸的直接测定。此方法可用于炸药的成分分析，也可作为生产苦味酸或以苦味酸为原料的工厂周围地面水受苦味酸污染的监测手段。 　　第四为但核苷酸和DNA的化学发光行为研究。DNA是生命遗传物质，DNA分析在当今蓬勃发展的生命科学研究中，显得日益重要。 聚合酶链反应（PRC）技术能够从复杂的DNA分子群体中选择性地复制一段特异的序列，使某一DNA片断得到特异性的扩增, 进而方便了DNA的分析。PCR技术中，人们需要对PCR产物DNA进行定量分析，现有方法主要是将PRC混合物通过凝胶电泳分离后用溴乙锭进行荧光分析，因凝胶电泳法费时、费劲，后来人们又提出不用凝胶电泳的以DNA杂交分析为基础的酶联显色杂交分析和电致化学发光杂交分析，但这两种方法因分析步骤多，人们又研究出了不用分离，操作简便的利用能量转移的荧光分析法。此法虽好，但需要一套贵重的仪器设备，实际来源复杂，且昂贵。化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽、操作简单、设备要求低等特点，用化学发光法作为PRC产物DNA的定量分析手段至今未见报道，本文试图通过单核苷酸与DNA及引物对某个化学发光体系的化学发光行为的不同，从而不用分离就能快速地进行定量分析，抱着这样的设想，第一阶段对4种dNTP、引物和DNA的化学发光行为进行了研究，发现在Cuˉ（2+）-H_2O_2 这样一个简单的化学发光体系中，这六种化合物对此体系的化学发光的影响有较大的差异，其中，DNA和引物对此体系不产生影响，而单核苷酸的代表dNTP对此体系有强烈的增强化学发光作用（信号比空白液10倍左右），且增强的发光信号与dNTP的浓度呈良好的线性关系，方法的精密度也能保证（RSD为8%），这一结果基本达到了我们预期的目的，本文的研究结果为建立化学发光法定量分析PCR产物DNA提供了可能。