● 摘要
研究背景及目的
红缘拟层孔菌 [Fomitopsis pinicola(Sw.:Fr.)P. Karst] 为世界性分布的木腐真菌，因其具有一定药用价值在西方国家以及中国、日本、韩国等亚洲国家均有广泛应用。例如，在西方国家，红缘拟层孔菌主要用于治疗头晕、恶心和肝病等；而在中国，其主要用于祛风除湿、解热、强心、补肺益肾、和胃健脾、安神定志、扶正培本、滋补强壮。现代药理学研究表明，红缘拟层孔菌对脑溢血、心脏病、糖尿病、贫血、肾炎、支气管炎等病也有较好疗效。近年来，红缘拟层孔菌醇提物的抗肿瘤研究也屡见报道。因此，本论文以红缘拟层孔菌中细胞毒性较强的氯仿提取物（FPKc）为主要研究对象，分析了其中的化学成分，评价了细胞水平和整体动物水平的抗肿瘤效果，并对FPKc杀伤肿瘤细胞的作用机制进行初步研究。旨在为具有自主知识产权的抗癌新药研发提供理论依据，同时为红缘拟层孔菌应用于结肠癌的临床治疗提供科学参考。
研究方法及结果
首先，建立高效液相色谱法，以茯苓酸，麦角甾醇和去氢齿孔酸标准品作为对照，定性定量分析红缘拟层孔菌氯仿提取物(FPKc)的化学成分。结果显示，麦角甾醇，茯苓酸和去氢齿孔酸在FPKc的含量分别为10.5%，3.56%和0.25%。此外，HPLC 分析显示，经FPKc作用后的SW-480细胞裂解液中有麦角甾醇存在。
其次，MTT实验检测了FPKc对三种结直肠癌细胞的毒效应，结果表明，FPKc能不同程度抑制体外培养的结直肠癌SW-480、SW-620、Caco-2细胞的增殖，并呈现时间、剂量依赖性；不同的结直肠癌细胞对FPKc的敏感程度也具有差异性，药物作用48 h后，SW-480和SW-620细胞的半数抑制率 （IC50）分别为190.28 μg/ml和143.26 µg/ml，而药物作用72 h后，FPKc对Caco-2细胞才表现出明显的杀伤作用。FPKc杀伤结肠癌细胞的作用机制研究表明，其能够诱导SW-480细胞发生凋亡，HO染色后，荧光显微镜下能够观察到明显的核凝集现象；流式细胞仪分析结果显示：FPKc能够对SW-480细胞的DNA造成明显损伤，并引起细胞G1期阻滞；Western blotting结果显示，FPKc能够明显活化Caspase-3和PARP，下调Bcl-2的表达；此外，FPKc能够引起细胞内谷胱甘肽含量的下降，进而引起胞内活性氧的积累，最终导致细胞凋亡。同步的研究结果也提示，FPKc中相对含量较高的ES同样能够诱导SW-480细胞发生凋亡。
接下来，通过损伤修复和Transwell实验研究了FPKc对SW-480细胞迁移能力的影响，结果显示，高浓度FPKc对SW-480细胞的迁移抑制率高达70%。借助免疫荧光法发现FPKc能够显著抑制SW-480细胞胞外基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达。同步的研究结果也提示，FPKc中相对含量较高的ES同样能够下调MMP-2和MMP-9的表达，并抑制SW-480细胞的迁移。
最后，利用腹腔注射和皮下接种构建S180荷瘤小鼠模型，与对照组相比，FPKc能够显著抑制S180实体瘤体积，延长腹水瘤小鼠的存活期，并明显改善荷瘤小鼠的生存质量。
结论
FPKc含有麦角甾醇，茯苓酸和去氢齿孔酸，其中麦角甾醇能够被人结肠癌SW-480细胞摄取，可能为FPKc发挥抗肿瘤作用的主要成分。体外实验证明，FPKc损伤细胞DNA，引起细胞周期阻滞于G1期，进而诱导细胞发生凋亡，并且胞内活性氧的过度积累可能是导致细胞发生凋亡的重要诱因；FPKc还能够通过下调基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的表达，抑制SW-480细胞的迁移；同步实验提示，麦角甾醇亦可抑制结肠癌细胞的增殖，其抗肿瘤作用机制与FPKc相似，由此佐证麦角甾醇可能是FPKc主要的抗肿瘤活性成分之一。在体实验进一步表明FPKc能够显著抑制S180荷瘤小鼠体内肿瘤细胞的生长并延长荷瘤小鼠的存活期。