题目：秦艽组织培养及形态发生研究

秦艽是我国传统常用中药，性苦、辛、平，微寒。现代药理研究表明秦艽具有抗风湿、解热、镇痛、降压、抗菌等多种功效。本实验以秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）幼苗为材料，较系统的研究秦艽组织培养与快速繁殖技术，通过胚胎发生途径建立其植株再生体系，并对胚状体发生过程从形态学、组织学等方面进行了研究，对应用生物技术繁育秦艽优良种苗具有一定的意义。 （一）愈伤组织培养：在附加一定浓度的BA和NAA的MS培养基上经过2周以上的培养，95％以上的秦艽叶片和胚轴外植体可产生绿色愈伤组织。这些愈伤组织在含NAA配合一定浓度BA或2,4-D的培养基上培养3周可增殖15倍以上。暗培养对秦艽愈伤组织的诱导和增殖没有明显影响，但可以减缓愈伤组织老化；与其他植物生长调节剂相比，NAA对秦艽愈伤组织的形成有显著影响。 （二）无菌苗的增殖培养：无菌苗在含1 mg·L-1 NAA和1 mg·L-1 BA的生长培养基上培养4周后，幼苗的高度可增长4.30倍，20％的幼苗可形成丛生芽，四周内芽增殖倍数为2～3倍。 （三）不定根的诱导：下胚轴、幼叶和不定根在附加3 mg·L-1 NAA＋0.1 mg·L-1 BA的培养基上培养4周后，形成白色、粗短、表面有细小绒毛的不定根，这些不定根可用于愈伤组织和胚状体的诱导。 （四）胚胎发生：由胚轴诱导产生的淡绿色、生长迅速的愈伤组织在含NAA和2,4-D的培养基上培养4周后可形成黄白色疏松易碎的胚性愈伤组织。这些愈伤组织在附加NAA和2,4-D为0.5 mg·L-1或2 mg·L-1的MS培养基上培养4周后的增殖倍数可达4.5倍以上，并且能较好的保持胚状体的发生能力。胚性愈伤组织在含0.5 mg·L-1 2,4-D和0.5 mg·L-1 NAA的培养基上培养4周后发生胚状体。大约66.7％的球形胚在附加0.5 mg·L-1 BA和0.5 mg·L-1 NAA的MS培养基上可发育成具子叶的胚状体，在不含植物生长调节剂的MS培养基上90％的具子叶的胚状体可萌发形成完整再生植株。 （五）影响胚胎发生的因素：（1）外植体的影响。秦艽叶片、胚轴、不定根和愈伤组织都能通过间接途径诱导胚状体的发生，以叶片为外植体诱导胚状体，在一次培养中通过间接途径形成的胚状体，形态变化大，畸形胚多，愈伤组织化严重；以胚轴作为外植体，先诱导愈伤组织，转接后诱导形成的正常胚状体多，并且形态较均匀；不定根可以通过直接途径诱导胚状体的发生，但是产生的胚状体多为畸形。（2）植物生长调节剂的影响。NAA对胚性愈伤组织、体细胞胚的诱导等都有促进作用，高浓度的BA明显抑制体细胞胚的形成；附加0.5 mg·l-1 NAA和0.5 mg·l-1 2,4-D的MS培养基可使27.8％的愈伤组织发生正常的胚状体；含2 mg·L-1 NAA和2,4-D的MS培养基使30％的不定根产生胚状体；含3 mg·L-1 NAA配合0.1 mg·L-1 BA 的培养基可使13％的不定根形成胚性愈伤组织，进一步培养可形成胚状体和完整再生植株。（3）球形胚状体的来源影响胚状体成熟。在含3 mg·l-1 NAA＋3 mg·l-1 IBA＋1 mg·l-1 KT的MS培养基上诱导产生的胚状体比在附加0.5 mg·l-1 BA＋4 mg·l-1 NAA＋0.3 mg·l-1 KT的MS培养基上诱导产生的胚状体能更好的发育成正常的具子叶的胚状体。 （六）组织学观察：通过连续石蜡切片观察胚状体的形成过程，结果发现秦艽胚状体的发育过程与合子胚的发育过程相似，经原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚发育成具子叶的胚状体。根据观察结果推测秦艽胚状体的起源为单细胞起源。 （七）超微结构观察：通过透射电镜观察得知秦艽胚性细胞与普通愈伤组织在超微结构上的差别主要在于细胞器数量的变化。胚性细胞的细胞质浓厚，细胞器多，有丰富的线粒体、粗面内质网等，表明细胞生长代谢较为活跃。