● 摘要
随着人们消费观念的改变，天然药物市场的需求量越来越大。目前植物是天然药物的主要来源，且资源有限，因此，大家尝试应用植物组织与细胞培养手段生产有用次生代谢产物，而此法获得的代谢产物产量低，成本高，阻碍了商业的发展。据报道，诱导子在植物组织培养过程中能快速、专一和选择性地诱导植物细胞内某些特定基因的表达，提高有用次生代谢产物的含量。内生真菌与宿主长期共存过程中形成了互利共生关系，可作为诱导子提高宿主次生代谢产物的含量。
本实验以丹参内生真菌为诱导子对丹参愈伤组织进行诱导，研究内生真菌诱导子对丹参愈伤组织生长和丹参酮IIA合成的作用；从生理生化特性与基因表达情况分析诱导子对愈伤组织的生理效应及愈伤组织中丹参酮IIA合成关键基因的影响；愈伤组织及其提取物对内生真菌生长的影响及不同蔗糖浓度下内生真菌对丹参组培苗生长的作用，为进一步研究植物与内生真菌互作机制及其过程中的信号传导途径提供理论依据。具体研究结果如下：
（1）愈伤组织生长曲线的测定
丹参愈伤组织在0～36天生长周期中，起初生长缓慢，9～24天生长速度较快，30天愈伤组织生物量达到最大，30天后生物量逐渐下降并出现组织褐化现象。
（2）内生真菌与丹参愈伤组织共培养
6株内生真菌TR21、NU251、U104、NU204、NU151、NU256与丹参愈伤组织共培养，其中TR21、NU251、U104、NU204可促进丹参愈伤组织中丹参酮IIA的合成。
（3）菌液诱导丹参愈伤组织
以3倍浓缩的内生真菌发酵液为菌液诱导子诱导愈伤组织，发现TR21、NU251、U104、NU151菌液可有效提高愈伤组织中丹参酮IIA含量，且浓度为0.8mg/mL的菌液诱导效果优于0.4mg/mL。
（4）菌丝提取物诱导丹参愈伤组织
以内生真菌菌丝提取物为诱导子诱导丹参愈伤组织，发现NU151、NU256菌丝提取物对愈伤组织中丹参酮IIA的合成有促进作用。浓度为15mg/L的NU151诱导效果优于10mg/L和20mg/L，20mg/L的NU256菌丝提取物诱导效果优于10mg/L和15mg/L。
（5）内生真菌与愈伤组织生长的相互影响
内生真菌与愈伤组织共培养时，愈伤组织的生长受到一定程度的抑制，同时愈伤组织对TR21、NU251、U104、NU204菌株的生长也有抑制作用；菌液诱导子与菌丝提取物添加至愈伤组织继代培养基中，愈伤组织的生物量下降；培养基中分别添加过滤除菌和高压灭菌愈伤组织提取物，与对照组相比，高压灭菌愈伤组织提取液对U104菌株的生长有促进作用；第10天，过滤除菌愈伤组织提取液对TR21菌株的干重有促进作用。
（6）诱导子对愈伤组织生理效应的影响
U104菌株、浓度为0.8mg/mL的U104菌液和浓度为20mg/L的NU256菌丝提取物诱导愈伤组织，愈伤组织中与丹参酮IIA合成相关的POD活性高于对照组，与防御有关的PPO活性同样高于对照组，CAT活性在前期低于对照组，后期高于对照组；MDA含量亦比对照组高，其中U104菌株处理的愈伤组织中MDA含量最高。
（7）愈伤组织中丹参酮IIA合成相关基因的表达分析
实时定量PCR检测0.8mg/mL U104菌液诱导的愈伤组织中与丹参酮IIA合成相关的关键基因HMGR1、GGPPS1、CPS1、DXS1的表达情况，GGPPS1基因表达水平比对照组高7倍；HMGR1表达水平比对照组高5倍多；CPS1的表达水平与对照组相比无显著差异；DXS1表达水平比对照组高6倍多。
（8）不同蔗糖浓度下内生真菌NU151对丹参组培苗生长的影响
MS培养基中添加10～30g/L蔗糖时，NU151菌株对丹参组培苗的促生作用随蔗糖浓度的增加而增强，当蔗糖浓度大于40g/L时，对丹参组培苗的生长有抑制作用。