● 摘要
黄酮类化合物是较早被人类发现的一类天然化合物，是植物中分布最广的一类物质。其中槲皮素是含量最高，研究最多的黄酮类化合物之一。它具有多酚结构，因而具有抗氧化活性，已经证实它对人体健康具有多方面的有益作用，在相关疾病的预防和治疗、延缓衰老等方面显示出良好的应用前景。然而，一些研究也表明，在某些条件下，槲皮素会表现出一定的促氧化作用，能够共价结合蛋白质和DNA等分子，对生物组织和生命体造成损害，不利于人体健康。本文以红细胞和鸡卵清溶菌酶淀粉样纤维为体外模型，研究槲皮素与谷胱甘肽和溶菌酶淀粉样纤维的相互作用。
主要实验方法和实验结果
一、槲皮素与谷胱甘肽的相互作用
1.紫外光谱扫描分析
将槲皮素和谷胱甘肽在一定的条件下相互作用后，取出样品作紫外光谱扫描。发现样品的吸收峰发生了偏移，即在370nm处发生了红移，峰形也略有变化，同时吸收强度也有所下降，表明槲皮素和谷胱甘肽发生了反应或者生成了某种复合物。半胱氨酸上的巯基是谷胱甘肽（GSH）的活性基团，槲皮素通过巯基亲电加成形成槲皮素-谷胱甘肽加合物。
2.定量分析槲皮素和谷胱甘肽结合的比率
在槲皮素和谷胱甘肽的相互作用的研究中，定量分析了槲皮素和谷胱甘肽的结合比率。实验结果显示，固定槲皮素的浓度不变，依次加入不同浓度的谷胱甘肽，当槲皮素和谷胱甘肽的浓度比为1:1时出现一个拐点，吸光度值基本趋于水平不变，这时可以推测出槲皮素可能是和谷胱甘肽按物质的量1:1结合的。
3.HPLC分析槲皮素和谷胱甘肽的相互作用
用高效液相色谱法分析了槲皮素和谷胱甘肽的相互作用情况。将槲皮素和谷胱甘肽以相同的浓度混合，在特定的条件下孵育，HPLC法结果显示，槲皮素和谷胱甘肽作用后的样品组与对照组相比，保留时间发生了变化，峰的强度也有所下降，进一步证实槲皮素和谷胱甘肽的相互作用。
4.SDS-PAGE膜蛋白电泳分析槲皮素和谷胱甘肽的相互作用
将槲皮素处理红细胞膜蛋白，之后进行SDS-PAGE膜蛋白电泳，发现槲皮素能够诱导红细胞膜骨架蛋白聚集，这说明槲皮素对红细胞膜有氧化应激作用，使红细胞膜蛋白产生促氧化损伤。槲皮素和GSH作用后，加入红细胞膜共同孵育后进行SDS-PAGE分析，骨架蛋白聚集程度减弱，说明GSH可以抑制槲皮素诱导的促氧化作用。
5. ESI-MS分析槲皮素和谷胱甘肽的相互作用
用ESI-MS分析了槲皮素和谷胱甘肽的相互作用情况。将槲皮素和谷胱甘肽以相同的浓度混合，在特定的条件下孵育后，用正辛醇萃取，之后进样检测。质谱结果显示谷胱甘肽（相对分子质量307.33）图谱上出现准分子离子峰[M+H]+ m/z 308.09，以及同位素峰m/z 309.09和m/z 310.08。槲皮素（相对分子质量为302.24）出现准分子离子峰[M-H]- m/z 301.05，以及槲皮素二聚体的质谱峰m/z 603.10。当二者相互作用后，质谱图中产生系列碎片 m/z 606.76、588.40、568.77、557.78、546.78、535.79、524.80、508.79、497.80。对上述数据进行分析可以发现 m/z 606.76是槲皮素氧化后的醌式中间体与谷胱甘肽（相对分子质量为307.33）的巯基共价结合产生的碎片。而其余碎片是由槲皮素经过丢失中性碎片CO和H2O裂解后与GSH共价结合形成的。上述数据可以充分说明槲皮素和谷胱甘肽共价结合形成了复合物。
二、槲皮素对溶菌酶淀粉样纤维的作用
⒈ 作用条件的选择
将槲皮素溶液稀释在磷酸盐缓冲溶液（PH=7.4)中，在一定的条件下水浴不同的时间后，作紫外光谱扫描，可以发现水浴不同的时间后槲皮素在370nm处没有发生位移，表明槲皮素在这样的偏中性的条件下比较稳定，没有发生分解，但吸光度值有所增大，可能是由于随着时间的延长槲皮素溶解度下降，有固体颗粒析出发生了光散射的缘故。因此，我们在下面的实验中将槲皮素和溶菌酶淀粉样纤维在微碱性（pH=8.0）的条件下发生作用。
⒉ 时间效应
槲皮素与成熟的溶菌酶纤维作用后产生无定形沉淀，离心，取上清，通过考马斯亮蓝测蛋白含量的方法测定上清液中含有的蛋白含量，以此来判定槲皮素对成熟的溶菌酶纤维蛋白的沉积作用。结果所示随着孵育时间的增长，上清液中蛋白含量减少。这说明槲皮素能够使成熟纤维转变为无定形聚集体。
⒊ 浓度效应
不同浓度的槲皮素分别与成熟的淀粉样纤维作用一定时间（约1h）后，随着槲皮素浓度的增高，上清液中测定的蛋白含量减少。说明槲皮素对成熟纤维的沉积作用是与浓度成正相关，槲皮素的浓度越高，沉积作用越大。
⒋ 槲皮素对溶菌酶纤维所致的红细胞膜蛋白损伤的影响
将溶菌酶淀粉样纤维和红细胞进行相互作用，用SDS-PAGE检测红细胞膜蛋白谱带。我们可以发现溶菌酶纤维导致膜骨架蛋白聚集，蛋白条带有不同程度的减弱甚至消失。也就是说孵育不同天数的溶菌酶纤维对红细胞膜蛋白有损伤作用。
将槲皮素、成熟的溶菌酶纤维与红细胞膜相互作用，用SDS-PAGE检测红细胞膜蛋白谱带。发现槲皮素对溶菌酶纤维所导致的红细胞膜骨架蛋白的损伤有一定的保护作用，也就是说在一定程度上槲皮素可以抑制溶菌酶淀粉样纤维对红细胞膜蛋白的损伤。
⒌ 槲皮素对溶菌酶纤维诱导红细胞溶血的抑制作用
溶菌酶淀粉样纤维对细胞有毒性作用，本实验以人的红细胞为模型，选取同一孵育天数的成熟的溶菌酶淀粉样纤维与不同浓度的槲皮素相互作用，来检验槲皮素对溶菌酶淀粉样纤维诱导红细胞溶血的抑制作用。实验结果表明，经槲皮素处理过的溶菌酶淀粉样纤维对红细胞的溶血作用有所抑制，说明槲皮素能够抑制溶菌酶的淀粉样纤维化，破坏成熟的淀粉样纤维结构，并且随着槲皮素浓度增大到一定程度，这种抑制作用会减弱。
结论
槲皮素能够和谷胱甘肽发生作用生成复合物。我们推断是槲皮素的促氧化作用导致氧化过程中形成醌式中间体，然后共价结合到谷胱甘肽的巯基上生成槲皮素-谷胱甘肽加合物。此外，槲皮素能够抑制溶菌酶淀粉样纤维化，破坏溶菌酶淀粉样纤维结构，使其转变为无定形聚集体，从而抑制溶菌酶淀粉样纤维的细胞毒性作用。
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