● 摘要
摘 要
泡沫病毒（Foamy Virus, FV）基因组中央部位（即pol基因3′末端）至少存在4个3′聚嘌呤序列（Polypurine Tract, PPT）的拷贝，称之为中央聚嘌呤序列（Central Polypurine Tract, cPPT）。研究表明，其中一个cPPT可作为引物起始合成病毒（+）DNA的下游序列，形成泡沫病毒（+）DNA的双起始合成机制。这一机制使得病毒基因组复制完成后可在其（+）DNA中形成一个gap结构；同时在逆转录过程中缩短了泡沫病毒单链DNA暴露的时间。目前对于泡沫病毒基因组中由cPPT引起gap结构的起始核苷酸位点、终止核苷酸位点、gap断裂区域精确长度以及真正启始下游（+）DNA合成的cPPT元件仍存在争议。另外，3′PPT和cPPT双起始合成（+）DNA机制能否加快泡沫病毒基因组逆转录的完成，减小细胞酶类特别是细胞先天防御酶类APOBEC3家族对病毒逆转录的影响需要更为深入的研究。
本研究首先运用生物信息学方法对NCBI数据库中不同来源的泡沫病毒基因组中pol基因3′末端进行多序列比较分析，确定序列与功能保守的区域后，设计引物；用含有原泡沫病毒基因组的pHSRV13质粒瞬时转染BHK-21细胞，制备病毒粒子并提取病毒DNA/RNA。以病毒DNA/RNA为模板，采用3′和5′末端转移技术确定gap的起始、终止核苷酸和精确长度。在对gap结构进行了详细分析的基础上，以实验室前期构建的pShuttle-cis为基础载体，运用overlap PCR、酶切、连接等分子生物学实验方法对pShuttle-cis载体中的cPPT序列分别进行基因缺失、替代、点突变，构建了pShuttle-cis/cPPTD、pShuttle-cis/cPPTR、pShuttle-cis/cPPTM1和pShuttle-cis/cPPTM2等一系载体；通过overlap PCR和同源重组技术，向pShuttle-cis系列载体序列中插入原泡沫病毒的3′PPT序列，成功构建了pShuttle-gRNA、pShuttle-gRNA/cPPTD、pShuttle-gRNA/cPPTR、pShuttle-gRNA/cPPTM1和pShuttle-gRNA/cPPTM2载体；同时还构建了pCI-bet和pCI-APOBEC3G两个表达载体，为后期cPPT功能的研究提供了一定的基础。实验结果表明：
1.
采用磷酸钙法将包含有泡沫病毒基因组全长的pHSRV13质粒瞬时转染到BHK-21细胞，48 h后超速离心获得病毒粒子。用实验室前期制备的Gag抗血清，利用Western Blot技术，在病毒粒子中检测到了71 kDa和68 kDa两条蛋白条带，同时在核酸水平经过PCR扩增也检测到了gag基因，说明细胞转染成功，获得了泡沫病毒粒子。
2.
利用末端转移技术分别获得了由cPPT引起病毒（+）DNA上形成的gap区的3′和5′端的断裂位点，进而明确了gap长度在142 bp~735 bp范围内；另外，实验结果表明gap在3′端的断裂位点存在一个热点区域，但是在5′末端的断裂位点是随机的。
3.
利用基因缺失、定点突变、overlap PCR和同源重组等分子生物学技术成功构建了一系列同时含有cPPT和3’PPT的pShuttle-gRNA载体；利用PCR、酶切等技术成功构建了pCI-bet和pCI-APOBEC3G两个表达载体。