题目：电化学发光DNA分析方法的研究

DNA杂交分析技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异DNA序列片段的有力工具。它已广泛应用在生命科学，尤其是医学的各个领域。传统的DNA分子杂交采用的是放射性标记的检测方法，这种方法虽然灵敏度高，但存在放射性物质对人体及环境的危害。自20世纪80年代以来，各种非同位素如酶、荧光素、生物素、地高辛标记的化学发光法和荧光分析法以及以电活性物质标记的电化学分析方法相继问世。这些方法虽然在一定程度上克服了同位素标记的缺陷，但由于存在灵敏度不够高或检测系统复杂或仪器价格昂贵或标记物不稳定等缺陷，还不能完全取代传统的分析方法。因此寻求简单、灵敏、准确、价廉的非放射性标记的DNA分析方法具有十分重要的现实意义。电化学发光（E1ectrogenerated chemiluminescence，ECL）是在电极上施加一定的电压使电极反应产物之间或电极反应产物与溶液中某组分之间进行化学反应而产生的一种光辐射。根据电化学发光的强度进行分析的方法称为电化学发光分析法。该法不仅具有化学发光分析的灵敏度高、线性范围宽和仪器简单等优点，而且具有电化学分析控制性强、选择性好等优点。近几年来，将电化学发光检测技术应用于生物分析的研究受到了人们的极大关注。本论文研究工作旨在研究ECL活性物质钌联吡啶（Ru(bpy)_3ˉ(2+)）衍生物的电化学发光性能，并以这些物质为标记物制备了灵敏的DNA-ECL探针，结合DNA杂交技术分子、自组装技术和纳米技术，将高灵敏度的ECL检测手段应用于DNA的序列识别及含量测定。本论文探索了三种简单、快速、灵敏的电化学发光DNA分析方法，并将其用于特殊DNA序列片段的测定。本论文研究工作是在国家自然科学基金“新型功能纳米材料组装电化学发光生物亲合传感器的研”（No．20375025）项目的资助下完成的。本论文由引言、研究报告两部分组成。第一部分为引言部分，引言部分介绍了电化学发光分析的原理、特点、体系，DNA组成和DNA分析的原理，概括和总结了DNA传感器的构造和各种DNA传感器的原理、特点及分析应用，评述了电化学发光分析法在杂交检测以及药物筛选方面的研究进展，最后阐述了本论文的目的和研究内容。第二部分为研究报告部分，研究报告由三部分组成。2．1电化学发光分析法检测特定序列DNA的研究结合DNA杂交技术和DNA自组装固定化技术，将高灵敏度的ECL检测手段应用于生命物质DNA的序列识别及含量测定。以Ru（bpy）_2（dcbpy）NHS为标记物制备了DNA-ECL探针，研究了DNA-ECL标记物的电化学发光性能并基此建立了电化学发光分析法检测特定序列DNA的分析方法。通过自组装技术将5末端带有巯基的目标-ssDNA（HS-ssDNA）固定到金电极上，然后与标记有钌联吡啶衍生物的已知序列ssDNA进行杂交反应，最后通过电化学发光信号的变化对特殊序列DNA加以测定。电化学发光分析信号与待测DNA浓度在3.4×1Oˉ(-10)～3.4×1Oˉ(-7)mol/L区间呈线性关系，方法检测限为1.2×1ˉ(-10)mol/L。对3.4×lOˉ(-8)mol/L的待测DNA进行11次测定，相对标准偏差为4.7％。初步实验结果表明，本文提出的以钌联吡啶为标记物结合自组装技术建立的电化学发光DNA分析方法是可行的。2.2基于夹心杂交技术电化学发光分析法检测特定序列DNA的研究由于利用自组装法将HS-ssDNA直接固定DNA到电极上，ECL检测的DNA链端需要巯基修饰，应用上受到一定的限制。本部分我们提出了电化学发光检测的夹心式DNA杂交分析方法。将DNA夹心杂交技术用于DNA杂交分析中，使我们要检测的DNA无须修饰并且提高DNA的杂交效率。该方法通过自组装技术将5，末端修饰有巯基单链DNA（HS-ssDNA，捕获探针）固定到金电极上，捕获探针与目标ssDNA进行杂交，淋洗除去未结合目标ssDNA，再与标记的检测探针ssDNA结合，形成捕获探针ssDNA-目标ssDNA．标记的检测探针ssDNA的夹心式三明治结构。电化学发光分析信号与目标ssDNA浓度在8.8×1Oˉ(-10)～8.8×10ˉ(-8)mol/L范围内呈线性关系，检出限为3.O×lOˉ(-10)mol/L。对8.8×1Oˉ(-9)moI/L的目标ssDNA进行11次测定，相对标准偏差为4.9％。初步实验结果表明，本文提出的基于夹心式DNA杂交测定特定序列DNA的电化学发光分析法是可行的。2.3纳米金组装电极上电化学发光分析法检测特定序列DNA的研究作为DNA电化学发光分析中不可或缺的重要环节，单链DNA在电极上的固定化研究具有十分重要的意义。纳米材料大的比表面和良好的电子传递特性能增强了DNA片段在电极上的固定程度。本文利用1.6己二硫醇分子为连接剂，将纳米金组装在金电极上。纳米金组装金电极上通过自组装技术将5末端带有巯基的目标-ssDNA（HS-ssDNA）固定到修饰电极上，然后与标记有钌联吡啶衍生物的已知序列ssDNA进行杂交反应，最后通过电化学发光信号的变化对特殊序列DNA加以测定。实验中利用电化学手段表征了HS-ssDNA在金电极上的固定过程，计算得到12个碱基的HS-ssDNA在修饰电极上的表面覆盖度为4.85×1Oˉ(14)molecules/cmˉ2。研究了固定的单链对其互补DNA的识别能力。由于纳米金具有较大的比表面积，经过金纳米颗粒修饰的电极对HS-ssDNA的固定量比未经修饰的金电极可提高近12倍，提高了该方法的检测灵敏度。对互补DNA的检出限为6.7×1Oˉ(-12)mol/L。