● 摘要
蛋白酶是一种水解蛋白质或多肽的水解酶，它与人体代谢过程如细胞生长与死亡、组织重塑和免疫防御等有关，作为生物标志物应用于临床检测。建立简单、灵敏、快速的生物标示物检测方法，对于疾病的预防、诊断和治疗至关重要。基于生物亲合反应的电化学发光传感器，通常是在电极表面进行，该分析方法具有灵敏度高，选择性好等优点。罗氏(Roche)全自动电化学发光免疫分析仪是目前最先进的免疫分析仪，是基于生物亲合反应建立的一种分析检测法。在电化学发光分析仪的基础上，结合磁性分离、生物素和亲合素等进行检测。然而，电化学发光传感器多为一次性传感器，需要固定电极、复杂的电极反应、洗涤、分离等多个步骤，使得基于生物亲和反应的电化学发光生物传感器难以重复使用。因此为了克服探针直接固定在电极表面步骤繁多，反应复杂等不足，提出了一种基于生物切割电化学发光探针的新型电化学发光生物分析系统，用于高灵敏度定量检测蛋白酶。
本论文基于生物切割磁珠电化学发光传感信号放大新方法用于定量检测蛋白酶，以前列腺特异性抗原(PSA)为目标物，以特定序列的寡肽(CHSSKLQK)为分子识别物质，钌联吡啶衍生物为电化学发光信号物质，建立了一种简单的固相合成磁珠电化学发光探针(Fe3O4@Au-peptide-Ru1)。为了提高检测蛋白酶的灵敏度，对切割产生的电化学发光信号物质通过AuNPs/Nafion修饰的电极进行富集，建立一种AuNPs/Nafion/GCE(PGE)富集和检测的新方法，并用于构建高灵敏度的电化学发光检测。
本论文由引言和研究报告两部分组成。第一部分为引言，简单介绍了电化学发光分析法的基本原理和电化学发光分析法的优点、电化学发光生物传感器的研究进展，综述了基于纳米粒子信号放大的电化学发光法在检测生物标示物中的应用；叙述了以肽为分子识别物质的生物传感分析法的研究进展；最后提出本论文的研究背景、研究思路、研究目的和研究内容。
第二部分为研究报告部分，由以下两部分组成：
一、利用静电吸附作用，将信号物质富集到Nafion和金纳米粒子修饰的电极表面；利用Nafion良好的成膜作用和金纳米粒子对发光信号的增强作用，构建稳定、灵敏的AuNPs/Nafion/GCE富集检测新方法。建立的信号放大方法对于均相溶液中Ru(bpy)32+的检出限降低至0.85×10-14 mol/L。从而应用于新型电化学发光成像分析系统,提高电化学发光成像对Ru(bpy)32+-TPA体系检测的灵敏度。为临床诊断和病理研究提供可视化信息，为电化学发光生物传感表征和分析提供技术支持。
二、基于生物切割磁珠电化学发光探针电化学发光生物传感分析系统对目标蛋白酶的定量检测进行了两种检测模式的测定。以前列腺特异性抗原(PSA)为目标分析物，以特定序列的寡肽(CHSSKLQK)为分子识别物质，钌联吡啶衍生物为电化学发光信号物质。建立了一种简单的固相合成磁珠电化学发光探针(Fe3O4@Au-peptide-Ru1)的新方法。当目标物PSA与Fe3O4@Au-peptide-Ru1反应时产生寡肽特定位点的生物切割，电化学发光检测在共反应试剂存在下对信号物质进行了两种模式的检测。一种是在裸铅笔电极上进行均相电化学发光检测，电化学发光强度与PSA浓度在1.0×10-11 g/mL - 1.0×10-10 g/mL之间内呈良好的线性关系，检测限为5.0×10-12 g/mL。另一种是切割后的信号物质通过修饰铅笔电极AuNPs/Nafion/PGE富集进行检测，电化学发光强度与PSA浓度在5.0×10-13 g/mL - 3.0×10-11 g/mL之间内呈良好的线性关系，检测限为 8×10-14 g/mL。结果表明在Nafion/AuNPs/PGE上检测PSA获得了极低的检出限80 fg/mL和高度重现性(测量6次结果的RSD为6.4%)。利用建立的AuNPs/Nafion修饰电极富集检测新方法，提高蛋白酶切割产生的电化学发光信号的灵敏度。