● 摘要
摘 要
氯过氧化物酶（CPO）是从海洋真菌Caldariomyces fumago中分离出来的一种血红素糖蛋白酶（42kDa）。与heme-imidazole 血红素过氧化物酶不同，CPO属于heme-thiolate 类型的过氧化物酶，它兼具细胞色素P-450的单加氧酶活性和过氧化物酶活性，并且具有广泛的底物适应性，目前被认为是过氧化物酶家族中应用最广泛的酶，可催化烯烃环氧化、羟基化、磺化氧化、过氧化以及去卤化等多种类型的反应。CPO非常稳定，在4℃时可保存2~3年不失活，应用前景看好。但与其它生物酶相似，CPO在高温、强酸、强碱、有机溶剂等极端反应环境中的稳定性较差，且不易从反应环境中分离出来进行重复使用，这些都制约了其大规模产业化应用。
将酶分子固定在一种固相载体上是解决这一问题的常用手段。而所选用的载体的性质和固定化方式对固定化酶的催化活性有着至关重要的影响。本论文选用表面易于功能化的氧化石墨烯（GO）为固相载体，根据CPO表面高度糖基化这一特点，选择-OH为固定化位点，基于凝聚素对羟基的特异性识别完成CPO在GO 表面的固载。与传统的以氨基酸残基上-NH2或-COOH为固定化位点不同，选择-OH为固定化位点可以避免因酶蛋白表面氨基酸构象的改变而导致的酶活性损失，体现了本论文在固定化策略上的创新。同时，本文采用CPO催化氧化降解三苯甲烷类染料孔雀石绿作为模型反应考察了固定化酶的性能，获得的主要结果如下：
(1)本论文采用Hummers法制备GO，通过XRD、UV-vis 、FT-IR、TEM和SEM等对其进行了表征。首先采用物理吸附法固定CPO(简称GO-CPO)，基于氧化石墨烯具有很大的比表面积和丰富的含氧基团，通过氢键、静电作用或者 π-π 键相互作用完成CPO的固载。同时CPO是一种表面高度糖基化的蛋白酶，因此本论文还通过凝集素对羟基的特异性结合进行CPO固定(简称GO-ConA-CPO)，这种定向固定化的方法选择性高，结合牢固，能使酶本身保持酶的构象和活性。通过红外表征，证明CPO很好地固定到了GO上。
(2)考察了GO-CPO固定化条件优化，先通过单因素试验设计得出CPO较合理的固载条件范围为：pH 2.5~3.5，时间20~30 min，温度10~20℃。在此基础上，进行了三因素三水平响应曲面法试验，综合确定了CPO固定化的最佳固定条件：pH 2.9、时间26 min、温度13℃，得出CPO的理论固载率54.33%，固载量为250 mg/g。GO-ConA-CPO的最佳固定条件：pH 2.5、时间90 min、温度30℃，最佳固载量为381.32 mg/g，固载效果很好。
(3)以孔雀石绿的降解为模型反应考察的氧化石墨烯固定化CPO的酶学性能表明：相同条件下与游离酶对比，固定化CPO的米氏常数Km均低于游离CPO的，表明酶对底物的亲和性增强；固定化酶的Vmax和kcat/Km均大于游离酶的，表明催化反应速率和对底物的专一性得到提高； GO-CPO和GO-ConA-CPO的热稳定性、酸碱稳定性、对H2O2浓度的稳定性和储存稳定性都明显高于游离的CPO，而且GO-ConA-CPO的稳定性强于GO-CPO；GO-CPO重复使用3次以后，染料脱色率为9.87%，而GO-ConA-CPO可以重复7次以后，染料脱色率为11.23%。
相关内容
相关标签