● 摘要
为探讨Sox 9α在中国林蛙（Rana chensinensis）成体性腺功能的维持中的作用以及辛基酚（Octylphenol, OP）对Sox 9α表达的影响。本研究首先克隆了中国林蛙精巢的Sox 9α基因，将其测序结果导入SeqMan序列拼接；分别用Blast, ORF, SignalP, ProParam, SMART, NPS@, SWISS-MODEL软件进行同源性分析，预测序列的开放阅读框、信号肽、蛋白分子重量、功能结构域、等电点、蛋白质的二级和三级结构。然后，选取两栖和爬行动物的12个物种进行ClustalW2比对，MEGA5.1建树，分析中国林蛙Sox 9α基因的进化地位。其次，用Semi-quantity RT-PCR检测Sox 9α在中国林蛙成体的精巢、卵巢、肾脏、肝脏、脑以及32-46期蝌蚪的表达。最后，将雄性中国林蛙成体暴露于10-5, 10-6, 10-7, 10-8 mol/L OP进行处理，分别在10、20和30d取其精巢，用Real-time Quantity PCR技术检测Sox 9α在精巢的表达。结果与分析如下：
1.在中国林蛙成体精巢中首次扩增到长为1580bp的Sox 9α cDNA序列，该序列包含一个1449bp的开放阅读框，其起始密码子与粗皮蛙(Rana rugosa)的位置一致。可编码一个含有482个氨基酸的蛋白分子，该氨基酸序列与粗皮蛙Sox 9α的相似度为97%，且无移码读码现象。与爬行动物密西西比鳄(Alligator mississippiensis) Sox 9α的相似度为85%，与红耳龟(Trachemys scripta) Sox 9α的相似度为85%。将该序列上传GenBank，其序列号为KC442293。对Sox 9α氨基酸序列的结构和功能进行预测，该序列不存在N-端信号序列，是一个非分泌蛋白，其分子重量为54 kDa，等电点为6.32。序列内除含HMG-box domain (105-175)外，还含有BEN domain (75-147), DnaJ domain (107-152), GIT domain (120-150), CG-1 domain (237-276), HSF domain (135-291), PAH domain (376-414)和DUF1518 (304-354) domain等结构域。蛋白质二级结构包含17.39%的α-螺旋，5.38%的延伸链和77.23%的自由卷曲。
2. ClustalW2比对并MEGA5.1建树显示，中国林蛙Sox 9α氨基酸序列在HMG-box结构域保守性较高。所选取的12个物种的进化关系可分为有尾两栖类、无尾两栖类和爬行类3群。中国林蛙和粗皮蛙共处一群，二者在进化关系上较为亲近。
3. Semi-quantity RT-PCR检测显示，Sox 9α在中国林蛙的精巢、卵巢、肾脏、肝脏和脑中均有表达，在精巢和卵巢中均显著表达。在32-38期幼体，43-45期雌雄个体及46期雌性个体中均有表达。表明Sox 9α可能参与幼体的性腺分化和维持成体性腺的功能。
4.将成体雄性林蛙暴露OP后，用Q-PCR技术检测精巢中Sox 9α mRNA显示，与对照组相比，各OP处理组Sox 9α mRNA的表达均显著下调。其中，暴露10 d，10-8 mol/L OP组的Sox 9α mRNA开始显著下降，随后呈现明显的剂量依赖性降低。暴露20 d，除10-8 mol/L OP组外，其他各组Sox 9α mRNA水平均呈现明显的剂量依赖性增高。暴露30 d，随着OP浓度的增加，Sox 9α mRNA的表达与OP浓度之间的关系不规律。总体显示，OP暴露可下调Sox 9α mRNA表达，但Sox 9α mRNA表达下降的程度与OP浓度、暴露时间之间关系的规律性不强。
5.原位杂交结果显示，Sox 9α mRNA阳性表达信号主要存在于林蛙精巢的生精细胞。
关键词: Sox 9α，克隆，中国林蛙，精巢，辛基酚