● 摘要
丹参(Salviamailtiorrhiza Bunge．)是我国传统中药，具有祛瘀止痛、 活血通经、清心除烦和滋补等作用，在临床上用于心脑血管疾病、癌症、抗衰老等 方面的治疗，效果显著。其脂溶性成分一丹参酮，表现出抗菌、抑菌、抗炎等多 种生物活性，是丹参的主要有效成份之一。 丹参酮类化合物多属于二萜类化合物，一般认为其合成途径应属于丙酮酸／ 磷酸甘油醛代谢途径。但有证据表明，丹参酮类化合物的生物合成途径也受到甲 羟戊酸途径的影响。在甲羟戊酸途径中，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 (3－hy droxy－3－methylglutaryl coenzyme A reductase HMGR)基因是甲羟戊酸途 径中的第一个关键酶，其下游产物的积累受HMGR活性的控制。本实验利用农杆菌 介导法将来源于构巢曲霉(Aspergillus nidulans．)的3－羟基－3－甲基戊二酰辅 酶A还原酶(HMGR)基因导入丹参，获得转基因植株。在建立丹参转化体系的同时， 为进一步利用基因工程技术调控丹参次生代谢产物含量等研究奠定基础。本实验 主要研究结果如下： (1)将来源于构巢曲霉的HMGR基因连同ubiquitin启动子以及nos终止子插 入pCAMBIA2301的多克隆位点，构建植物表达载体pCAMH。通过对表达载体酶切 验证和对目的基因进行PCR扩增检测，证实HMGR基因已插入：pCAMBIA2301多克隆 位点，然后将其导入农杆菌EHA105。 以丹参无菌苗的叶片为外植体，以抗性芽的发生和植株再生为指标，利用农杆 菌介导技术，将外源HMGR基因导入丹参中，获得了一批转化丹参的抗性植株。 (2)在基因转化过程中，研究了农杆菌介导丹参转化的影响因子，结果表明： 农杆菌浸染时间和菌液浓度均对丹参的转化有明显的影响。浸染时间以20min 左右为宜：菌液浓度以OD6oo0.2为宜。在外植体预培养、农杆菌浸染以及共培养阶 段，添加乙酰丁香酮对丹参转化频率并无明显影响。 (3)通过对转基因丹参进行PCR检测，特异性扩增Kana抗性植株总DNA中外 源HMGR基因片段以及对其进行Sout hern印迹杂交分析，证实HMGR基因已顺利整 合到转基因丹参植株的基因组，转化效率为70％。提取Kana抗性转基因丹参植 株的总RNA并进行RT-PCR。转基因叶片总RNA经RT-PCR后，均可见HMGR基因 mRNA扩增条带，表明HMGR基因在转基因丹参中mRNA水平上已有表达。 通过本项研究，我们将HMGR基因转入丹参基因组中，并由此建立了HMGR基 因转化丹参的高频再生体系。该项研究结果为今后进一步研究转基因丹参中外源 HMGR基因在植物体内的表达，甲羟戊酸途径对于丹参酮类化合物生物合成的影响 以及明确丹参酮类化合物合成途径的研究等奠定了基础。