● 摘要
miRNA（microRNA）是一种碱基数20-25 nt大小的非编码单链RNA。它的发现使得人们可以在更为广泛的范围研究各种生命现象。特别重要的是，大量的研究发现miRNA作为致癌或抑癌基因在癌症的发生、发展过程中起到了关键性的作用，而miRNA的定量检测又成为miRNA功能研究的基础。本论文根据广泛应用的PCR技术，提出了茎环酶连接PCR定量检测miRNA的方法。一对DNA探针与模板miRNA退火成双链RNA-DNA结构，T4 DNA连接酶分别将DNA探针的5’磷酸基团和3’羟基基团进行连接。连接后的DNA用于下一步PCR的检测。在传统的连接酶缓冲液中，T4 DNA连接酶对以miRNA为模板的连接效率非常低，通过对连接条件的优化，即在低ATP、高连接酶浓度、Mn2+离子的参与下，连接效率大大提高。在提高RNA模板连接效率的同时，发现T4 DNA 连接酶在没有模板的参与下也会催化游离的DNA单链自连，而自连的DNA探针会在PCR过程中进行放大，产生很高的背景信号。对此改进设计了具有茎环结构的探针，通过与线性探针的连接对比，茎环结构探针将非特异信号至少降低了100倍，同时优化参与反应的DNA探针浓度，发现在10 µL连接体系下，1010个DNA探针参与miRNA模板的连接能得到最佳的检测结果。T4 DNA连接酶被证实具有良好的单碱基错配的辨别能力，但是错配碱基的位置对于区分能力有很大的影响。设计与目标miRNA连接位点处各有2~8个相似碱基的5条干扰miRNA，经PAGE胶验证没有任何非特异的连接。即使连接位点处有相同碱基，茎环结构探针对于完全配对的双链RNA-DNA有高特异性连接。小鼠let-7族miRNA包括let-7a~7g，let-7i，同族序列之间只有1~2个碱基区别。为了进一步验证连接特异性，分别设计DNA 探针区分let-7族的8条miRNA序列，连接产物通过凝胶电泳和PCR检测得到非特异信号基本低于1%。miRNA前体包含有一段完整的miRNA序列，可能会对成熟miRNA检测产生干扰。通过对mir-1和mir-122前体和成熟体的检测，前体的检测信号强度为检测同浓度的成熟体miRNA的0.2%。将合成的mir-122、mir-1、mir-34a分别稀释成6个浓度梯度，标准加入曲线保持良好的线性，mir-122，mir-1最高检测灵敏度为105个分子，对于mir-34a, 可以达到104个分子。除此之外，将总RNA从0.2 μg梯度稀释至0.02 ng，验证四组miRNA在组织总RNA的检测灵敏度。考虑到miRNA荧光定量PCR检测实验中内参的重要性，应用本方法和传统的检测方法对U6 snoRNA以及mir-191进行检测，发现在10种组织中有相似的结果。以U6 snoRNA为内参，在小鼠10种组织的总RNA中分别构建mir-122、mir-1、mir-34a、let-7在10中组织中的相对表达图谱，得到mir-122和mir-1分别在肝脏中和肌肉中高表达，mir-34a，let-7在组织中有广泛的分布。通过将微流控芯片与RAM（Ramification Amplification，网状分支扩增）方法结合，实现对miRNA的检测。利用软光刻技术制作多层微流控芯片系统，在此系统中设计4种不同的反应：miRNA的反转录，环形探针的形成，连接以及RAM扩增。通过荧光信号的检测以及凝胶电泳，在微流控芯片上实现了miRNA的检测。