● 摘要
两栖动物作为水生向陆生过渡的特殊类型，具有卵无壳羊膜覆盖，皮肤裸露，渗透性强，对环境的变化极其敏感等特点，为了适应环境的变化，两栖类动物在长期自然进化过程中逐渐形成了由皮肤腺体分泌大量抗菌肽来抵御外源侵袭的防御机制。迄今为止，GenBank中收录的两栖类来源的抗菌肽500余种，占天然抗菌肽总数的三分之一。特别是蛙属（Rana）动物提供了超过400种抗菌肽，是抗菌肽资源的天然宝库。palustrin-2CE2以及brevinin-2CE是本实验室较早前于中国林蛙中克隆到的抗菌肽基因。初步的功能研究发现：体外合成的两种抗菌肽具有较强的抑菌，抑肿瘤活性，且溶血活性较低，在开发为临床药物方面具有极大的潜力。另一方面，用细菌细胞壁的有效成分脂多糖（LPS）去处理处于不同发育时期的中国林蛙，相关抗菌肽基因的表达均发生显著上调，提示这两种抗菌肽还有可能参与蛙类的免疫调控。
本研究以中国林蛙抗菌肽基因palustrin-2CE2，brevinin-2CE为研究对象，一方面通过RACE技术获取相应基因的完整cDNA序列；利用巢式PCR技术获取其完整基因组序列；通过同一基因cDNA与完整基因组序列的比对及生物信息学分析，明确相关基因的编码区结构组成；利用不同基因间的比较初步预测蛙类抗菌肽基因可能存在的基因结构上的共性。另一方面，利用依赖于PCR的染色体步移技术克隆palustrin-2CE2以及brevinin-2CE基因的5′侧翼序列；通过启动子分析软件对不同基因的5′侧翼序列进行预测分析；通过瞬时表达分析法将目的基因启动子区的完整或部分区段构建成带有萤火虫荧光素酶报告基因的表达载体，通过瞬时转染A6细胞系，研究palustrin-2CE2以及brevinin-2CE基因的启动子活性。主要结果如下：
1利用RACE的方法克隆得到brevinin-2CE的 5′UTR序列，结合前期研究结果，获得brevinin-2CE的cDNA全长序列，该转录本全长400 bp，由66 bp 5′UTR、237 bp ORF和97 bp 3′UTR组成，共编码79个氨基酸。
2利用巢式PCR，克隆到palustrin-2CE2基因的Ⅱ号内含子全长3470 bp。通过序列比对，确定该基因编码区由三个外显子，和两个内含子组成。按照5′端至3′端的方向排列，三个外显子的长度依次为： 65 bp，83 bp和 225 bp；两个内含子的长度依次为：3470 bp及911 bp。
3利用巢式PCR，克隆得到brevinin-2CE基因的编码区。通过与brevinin-2CE基因 cDNA序列的比对，明确brevinin-2CE基因编码区也由三个外显子和两个内含子组成。按照5′端至3′端的方向排列，三个外显子的长度依次为： 57 bp， 86 bp和 257 bp；两个内含子的长度依次为：3265 bp及2615 bp。
4利用RSE-PCR的方法克隆得到brevinin-2CE基因的 5′ 侧翼序列。通过与brevinin-2CE cDNA序列的比对，确定了该基因的转录起始位点（TSS）；在TSS上游的642 bp为启动子序列，利用PROMO 3.0对其进行预测分析，不仅发现了核心启动子元件TATA盒，还分别预测到一处c-Rel和一处NF-kappa B顺势作用元件，提示该基因可能参与中国林蛙体内的免疫调控。
5利用接头介导的PCR方法获取palustrin-2CE2基因的5′ 侧翼序列。通过与palustrin-2CE2 cDNA序列的比对，确定了该基因的TSS；在TSS上游的1504 bp为启动子序列，利用PROMO 3.0对其进行预测分析，不仅发现了核心启动子元件TATA盒，还分别预测到一处NF-kappa B和一处Rel A顺势作用元件，这与brevinin-2CE基因5′ 侧翼序列的预测结果趋于一致，提示这两个基因可能在表达调控机制方面具有相当的一致性。
6利用双报告基因检测系统对brevinin-2CE和palustrin-2CE2启动子区进行初步研究，发现这两个基因在正常状态下的启动子活性都较低，这可能与该基因作为应激基因发挥功能相关。另外初步的研究结果还表明，抗菌肽基因普遍存在的高度保守的5’UTR区段，可能对这一类基因的启动具有关键作用。