● 摘要
目的：
胰岛素抵抗（IR）是包括代谢综合征(MS)和糖尿病(DM)在内的多种代谢障碍类疾病的关键诱因，并贯穿于此类疾病病理进程的始终，其中，糖尿病肾病不仅是糖尿病并发症的一种，而且也是糖尿病发展为终末期肾病(ESRD)和肾衰而导致死亡的重要因素之一。研究表明，在IR还未真正发展为糖尿病或糖尿病肾病这一不可逆转的阶段前，是可以通过科学、有效的干预手段，来达到预防和治疗的目的，因此，本实验将以IR状态下大鼠肾脏损伤模型为研究对象，通过对模型组大鼠施加不同方式运动、MSTN抗体以及二者联合的干预手段，并对干预后结果进行分析，研究各干预方式对大鼠胰岛素抵抗肾脏损伤的改善机制，以期从中探寻出一种对胰岛素抵抗肾脏损伤具有防治意义的方法、手段，为临床预防和治疗糖尿病肾病及其相关疾病提供一个参考。
方法：
本实验选取SD雄性大鼠70只，两月龄、体重170~220g，大鼠先以普通啮齿类动物饲料适应性饲养1w后，从70只大鼠中随机挑选10只作为正常对照组（Normal Controls，简称 NC），并以普通啮齿类动物饲料继续饲养20w，其余60只大鼠则以自制高脂饲料无差别饲养12w，以诱导建立大鼠胰岛素抵抗肾脏损伤模型，判定模型构建成功的标准是以口服葡萄糖耐量实验（OGTT）、胰岛素糖耐量试验（ITT）和24h尿蛋白含量（每周对NC组和建模组大鼠24h尿蛋白测试一次）的检测结果作为评估依据；待大鼠胰岛素抵抗肾脏损伤模型构建成功后，将模型组的60只大鼠随机均分为6组：高脂模型对照/大鼠胰岛素抵抗肾脏损伤模型对照组（High Fat Diet，简称HF组）、MSTN抗体组（MSTN Antibody，简称 HM组）、中等负荷负重跑运动组/负重跑运动组（Medium Load Weight Treadmill Exercise，简称HML组）、有氧运动组（Aerobic Exercise，简称HA组）、负重跑与有氧运动联合组（Medium Load Weight Treadmill Exercise With Aerobic Exercise，简称HML+A组）和负重跑与MSTN抗体联合组（Medium Load Weight Treadmill Exercise With MSTN Antibody，简称HML+M组），除NC组、HF组外，其余5组根据其相应的分组，各进行8w不同方式的干预，而在此期间，包括HF组在内的其它5个干预组，均以高脂饲料继续饲养，并每隔10d对每组大鼠前肢抓力（连续测5次取均值）、体重测试一次；待8w干预期结束后，取大鼠全血血清，应用试剂盒对大鼠血清中CK、FFA、HDL-c、LDL-c、CHO指标进行测试；取大鼠双侧肾脏，做肾脏组织切片并应用HE染色、PAS染色、Masson染色和免疫组化的检测方法，分析各组大鼠经过不同干预方式后，大鼠肾脏损伤的改善程度和MSTN蛋白在肾脏中的表达量；通过提取大鼠肾脏皮质部mRNA，应用RT-PCR技术，对大鼠肾脏皮质部PI3K/Akt信号通路中关键蛋白分子和MSTN受体表达量进行分析，综合探讨各干预方式，对改善大鼠胰岛素抵抗肾脏损伤的分子机制和最优方案。
结果：
1. 经过12w高脂膳食诱导结束后，对模型组大鼠进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素糖耐量实验(ITT)的检测结果表明，HF组较NC组大鼠在对葡萄糖和胰岛素的反应敏感度上存在显著性差异（P＜0.05），表现出HF组大鼠对血糖的调控存在着一种“迟钝”的现象，另外，对大鼠24h尿蛋白含量的检测结果表明，HF组在建模期的第8w开始出现尿蛋白含量高于NC组的趋势，并在第10周时，这种差异呈现出P＜0.01的极显著性差异，最后通过OGTT试验、ITT试验和24h尿蛋白含量这三项检测结果，综合评定大鼠胰岛素抵抗肾脏损伤模型的成功构建。
2. 通过对各干预组（HML组、HA组、HM组、HML+A组和HML+M组）进行8w的干预期结束后， HML+A组和HML+M组较HF组大鼠在抓力、体重、腹膜脂肪重量以及腓肠肌重量上均存在明显的改善趋势，且组间差异性极显著（P＜0.01），而各组大鼠在Lee’s指数、比目鱼肌重量以及胰腺重量的干预结果上却不存在显著性差异，另外，单因素干预组（HML组、HA组和HM组）较HF组在大鼠体重、抓力、腹膜脂肪重量、股四头肌重量、腓肠肌重量以及胰腺重量上虽然存在一定程度的改善，但总的改善程度，却不如联合干预组那么显著；通过对大鼠双侧肾脏称重，计算大鼠肾脏肥大指数并进行组间比较的结果显示，HF组大鼠肾脏肥大程度和肾脏重量均高于其它各组，并呈现出显著性差异（P＜0.05）。
3. 各组大鼠血清指标的检测结果表明，HF组大鼠血清HDL-c含量低于其它各组，且存在显著性差异（P＜0.05）；而在大鼠血清LDL-c、CHO、FFA和CK的含量上，HF组普遍高于其它各组，其中，HF组与NC组、HA组在血清LDL-c的含量上，呈现出显著性差异（P＜0.05），HF组与HML组、HML+M组、HML+A组大鼠血清CHO含量相比，存在显著性差异（P＜0.05），另外在血清FFA和CK含量中，仅有NC组、HML组与HA组相比存在显著性差异（P＜0.05），而其余各组大鼠间均不存在显著性差异（P＞0.05）。
4. 对各组大鼠肾脏进行组织切片，并通过HE染色、PAS染色以及Masson染色结果表明，HF组大鼠肾脏表现出局灶型肾小球肾炎的现象，在显微镜下可以观察到肾小球基底膜严重增厚、血管袢模糊不清，部分肾小球区域出现脏层上皮与壁层上皮粘连和免疫细胞浸润现象，且在肾小球与肾小管之间还存在着大量的纤维化样变，呈现出肾小球萎缩和硬化的状态，但是通过与其它各组大鼠的肾脏组织切片结果进行对比，显示出各干预组大鼠肾小球损伤程度得到了一定程度的改善，尤其是联合干预组（HML+A组和HAML+M组）肾小球的改善效果尤为显著；另外通过对大鼠肾脏免疫组化的观测结果表明，HF组大鼠肾脏中MSTN蛋白表达量高于其它各组，并与NC组相比，存在极显著性差异（P＜0.01）。
5. 大鼠肾脏RT-PCR结果显示，各干预方式对大鼠胰岛素抵抗肾脏损伤均有一定程度的改善作用，这主要表现在与HF组相比，无论是PI3K/Akt信号通路的上游胰岛素受体表达量，还是下游的mTOR、Glut4信号分子的表达量上，均表现出不同程度的上调作用，而对其下游具有抑制作用的FoxO1和GSK-3β的信号分子表达上，则呈现出一定程度的下调作用；另外，各干预组大鼠肾脏MSTN受体的表达量明显低于HF组，这也从另一方面对大鼠肾脏PI3K/Akt信号通路起到了一定的促进作用。
结论：
经过8w的负重跑运动、有氧运动、MSTN抗体干预以及负重跑与有氧运动/MSTN抗体的联合干预后，就各组大鼠肾脏组织切片结果表明，干预组大鼠肾小球基底膜增生、炎症反应以及纤维化所导致的肾小球硬化和萎缩程度均已得到了初步的改善，尤其是联合干预组大鼠，肾小球各方面机能状态已基本趋于NC组肾小球机能状态；另外，对大鼠肾脏肥大指数和血清指标的分析结果表明，虽然各干预组均可对胰岛素抵抗导致的肾脏肥大具有一定的改善作用，但还是属联合干预组的改善效果更佳，而在大鼠血清CHO、HDL-c的含量上，各干预组与HF组相比较，均表现出一定程度的改善作用；最后对各干预组大鼠肾脏PI3K/Akt信号通路和MSTN受体的RT-PCR结果表明，各干预方式均可对大鼠胰岛素抵抗肾脏损伤具有良好的改善效果，这主要表现为与HF组相比，干预组大鼠不仅下调了MSTN受体和FoxO1、GSK-3β的表达量，而且还上调了胰岛素受体和PI3K/Akt及其下游mTOR和Glut 4信号分子的表达量，这在一定程度上，将对于IR的改善都是非常有利的，综上所述，虽然各干预方式均可以对大鼠胰岛素抵抗肾脏损伤产生良好的改善作用，但就综合的改善程度而言，还是联合干预组更具优势，而这种显著性的优势，也在提示我们，对于胰岛素抵抗肾脏损伤的防治，可以通过多渠道不同治疗手段的巧妙结合，势必会达到一种更有效、更安全、更全面的治疗效果，而这也为与IR相关的其它各类代谢性疾病的临床防治工作，提供了一个新的思路。