题目：基于化学修饰的氯过氧化物酶的催化活性和稳定性研究

 氯过氧化物酶(CPO)是自海洋真菌C.Fumago中分离出的一种血红素糖蛋白酶，CPO因其独特的活性位点结构而兼具过氧化物酶、过氧化氢酶以及细胞色素P-450的催化功能，目前被认为是已知的血红素过氧化物酶家族中应用最广泛的酶，并且具有广泛的底物适应性，因此CPO在环境生物催化、医药工业和现代合成化学中具有很大的应用潜力。 由于在反应体系中，经常会使用酸、碱、有机溶剂或反应温度较高等相对极端的条件，但在这样的环境中CPO易变性失活，这极大地制约了它的应用。研究如何提高CPO对温度、pH、有机溶剂等致失活因素的抵抗能力、增强其在极端反应环境中的适应性对提升酶的产业化应用潜能是很有意义的。 本文以CPO催化卤化2-氯-5,5-二甲基-1,3-环己二酮（MCD）为模型反应，分别采用添加剂法、小分子化学修饰和辅因子修饰法以期改善其催化性能。主要结果如下：                            （1）添加剂法：本文研究了三种多糖/低聚糖添加剂（水溶性淀粉、β-环糊精和糊精）在不同温度（20°C, 30°C, 35°C, 40°C 和50°C）和有机溶剂（甲醇, 1，4-二氧六环, 二甲亚砜和N,N-二甲基甲酰胺）中对CPO稳定性的影响，结果表明，三种添加剂都能有效的提高CPO的催化性能，在25°C时，相对活性分别是天然酶的1.32倍、1.35倍和1.58倍；与常温比较，高温时添加剂对酶的保护作用更明显，在35°C相对活性分别是天然酶的1.7倍、1.43倍和2.29倍在淀粉，β-环糊精和糊精作为添加剂时，即使在温度达到40°C时，相对活性仍然比常温时的高，而在50°C时淀粉和β-环糊精在最佳浓度时酶的活性仍比天然酶的活性高；在恒温50°C的水浴箱恒温5小时后，天然酶的残余活性仅剩下10%，而淀粉、β-环糊精和糊精作为添加剂存在时，最低的残余活性的也达到了20%，最高的达到了25%；而在有机溶剂中天然酶比有添加剂的酶失活剧烈，100分钟后天然酶的残余活性仅剩下70%，但是淀粉作为添加剂的酶的残余活性还有80%，β-环糊精作为添加剂的酶的残余活性还有85%，糊精作为添加剂的酶的残余活性还有88%。而且在这三种添加剂中糊精的效果最明显，说明糊精是最有效的添加剂。 （2）化学修饰法：选用1，2，4-苯三甲酸酐(TMA)、均苯四甲酸酐(PMDA)对氯过氧化物酶(CPO)进行化学修饰，与天然酶相比，修饰酶T-CPO和P-CPO的催化活性分别提高了54%和34%；在50°C时，经过温育2.5个小时后，CPO的活性仅剩下了18%，而T-CPO、P-CPO的活性还分别保留了30%和26%；在有机溶剂中时，天然酶失活比修饰酶剧烈，例如在DMSO中，当DMSO的含量达到15%时，天然酶的活性仅剩下19%，而T-CPO、P-CPO的活性还有40%和28%。而这两种修饰剂中1,2,4-苯三甲酸酐效果都比均苯四甲酸酐明显。选用的五种酸中十八酸（硬脂酸）提高幅度最大，达到了82%，经过酸修饰的酶的热稳定性和抗有机溶剂失活性能都得到了提高。说明所选的修饰剂是有效的。 （3）辅因子修饰法：利用苯酚、对硝基苯酚和对甲基苯酚修饰氯化血红素，合成双酯类衍生物。采用了质谱，紫外可见分光光度计进行表征，确定产物的结构。将合成的氯化血红素的双酯衍生物，与取出活性中心的氯过氧化物酶(apo-protein重组，研究重组酶的一些性质，并同天然酶进行比较。 （4）通过荧光光谱、圆二色谱以及紫外可见光谱等谱学研究手段结合酶促反应动力学参数的测定研究了修饰型CPO的二级蛋白结构及其活性中心微环境的变化。结果表明CPO的血红素辅基暴露程度增加，底物容易接近活性中心，同时CPO的α-螺旋结构得以加强，从而有效提升了酶蛋白的抗失活能力；酶促反应动力学研究表明：米氏常数Km的减小以及二级动力学常数Kcat/Km的增大说明CPO对底物的亲和力及识别的专一性得以改善，这是修饰酶活性提高的主要原因。