● 摘要
近年来，随着国民生活质量的提高和饮食结构的优化，含有丰富营养的乳制品在人们的膳食结构中占的比例越来越大。原料奶的质量已成为乳制品行业乃至整个社会普遍关注的问题。牛奶中体细胞数作为衡量牛奶品质的重要指标，其与牛奶中牛基因组DNA质量也有紧密联系，本研究将期望建立牛奶品质与牛DNA质量的关联性。因此，本试验以生鲜牛奶为原料，采用牛奶体细胞富集与SDS-苯酚法相结合的技术提取牛奶中牛基因组DNA，通过优化牛奶解冻、乳脂和乳蛋白的去除参数等关键环节，建立较稳定的牛奶中牛基因组DNA的提取方法；在不同贮藏温度和时间下，测定牛奶的乳脂肪、乳蛋白、乳糖、pH、酸度、干物质等品质指标，同时提取牛奶中牛基因组DNA，测定其浓度与纯度，并利用琼脂糖凝胶电泳法和PCR扩增技术，分别对所获DNA进行质量鉴定。以期明确牛奶中牛基因组DNA质量与牛奶品质的相关性，从分子层面探索牛奶品质变化的机理。主要研究结果如下：
1. 优化建立了牛奶中牛基因组DNA的提取方法。通过优化牛奶解冻方式，发现两步法（即在4℃下解冻，再常温解冻）优于一步法（常温直接解冻）和三步法（先在-20℃下解冻，再于4℃下解冻，最后常温解冻），可以获取较高质量的DNA，其浓度为（52.46 ± 2.4）ng/μL，DNA纯度为1.85 ± 0.8，凝胶电泳条带较清晰，分子量大小合适，且具有较好的PCR扩增能力；通过在牛奶体细胞富集环节中，优化离心参数去除乳脂和乳蛋白，发现获得优质DNA的最佳离心条件为7500 rpm和30 min。
2. 比较分析了不同贮藏温度和时间下牛奶中牛基因组DNA的质量。发现从贮藏在2℃牛奶中提取的牛基因组DNA质量最高。2℃牛奶中获得的牛基因组DNA的平均浓度为41.59ng/μL；DNA浓度与贮藏时间的关系为Y = 48.38e-0.0386X，R2 = 0.9782；DNA的平均纯度为1.92；凝胶电泳结果显示，DNA条带整齐单一，仅有略微的拖尾及弥散现象；PCR扩增牛内参引物和特异性引物，发现贮藏前7天奶样中所提DNA的扩增条带亮度几乎保持不变，且明显高于第15天的条带。10℃、20℃牛奶中获得的牛基因组DNA的平均浓度分别为27.28 ng/μL和16.91 ng/μL；DNA平均纯度分别为1.92和1.80；凝胶电泳结果显示，DNA条带亮度随着保藏时间的推移而快速减弱，10℃下牛奶第4天所提基因组DNA的条带亮度明显降低；20℃下牛奶第3天所提基因组DNA的条带亮度明显降低；PCR扩增牛内参引物和特异性引物结果显示，10℃下奶样前5天提取的牛基因组DNA均可以扩增出两个序列片段且亮度变化不大，第6天和第7天的PCR条带几乎不可见；20℃下贮藏下奶样前4天提取的牛基因组DNA均可以扩增出两个序列片段且亮度变化不大，第5天、第6天和第7天的PCR条带几乎不可见。
3. 比较分析了不同贮藏温度和时间下牛奶品质指标的变化及其与DNA质量的关联性。随着贮藏时间的推移，不同贮藏温度下的牛奶中乳脂肪含量和酸度值总体呈上升趋势，20℃下贮藏奶样指标的上升最为明显；乳蛋白、乳糖和pH值总体呈下降趋势，20℃下贮藏奶样中指标的变化趋势最为明显。建立了牛奶品质指标与DNA含量的关联性模型，乳脂肪含量与牛基因组DNA含量的模型为Y= -2×10-5X2+4.1983，R2 = 0.9921；乳蛋白含量模型为Y = 4×10-5X2–0.002X+3.2443，R2 = 0.9635；乳糖含量模型为Y = -0.0017X2+0.1612X+1.1418，R2 = 0.9813；pH值模型为Y = -0.0063X2+0.5611X-5.7214，R2 = 0.9541；酸度值模型为Y = 0.0135X2–1.3233X+46.684，R2 = 0.9065；干物质含量与牛基因组DNA含量线性回归关系不显著。
关键词：牛奶品质；牛基因组DNA；贮藏温度和时间；凝胶电泳；PCR扩增