题目：AChE固定化及其对有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的快速检测方法研究

AChE固定化及其对有机磷和氨基甲酸酯类农药残留的
快速检测方法研究

牛乐

摘要：有机磷和氨基甲酸酯类农药是最常见的两类农药，也是目前为止仍然最广泛使用的农药，它们是一种神经毒物，会抑制人及动物体内乙酰胆碱酯酶活性，引起中枢神经系统功能紊乱，出现中毒症状，以至危及生命。近年来，农药残留问题越来越多的受到人们的关注。虽然政府明令禁止将有机磷和氨基甲酸酯类农药中的高毒、剧毒品种用于蔬菜果品的生产，但是不少地方仍在使用这些国家明确规定在蔬菜上禁用的高毒剧毒农药，因食用含大量农残的蔬菜所引起的人畜中毒事件时有发生，带来了严重的食品安全问题。
气相色谱及高效液相色谱技术检测农药残留具有很高的准确性和灵敏性，但是它们需要昂贵的仪器设备、专门的操作人员以及严格的操作环境，检测周期也比较长，不适合于市场和田间的现场快速检测。传统的快速检测方法因为敏感生物元件酶的保存条件较为苛刻，检测又受提取液颜色的影响，给应用上带来诸多不便。因此，急需研究一些快速、灵敏、便捷的检测方法，将高残留的农产品阻挡在交易市场之外，以杜绝食品安全事故的发生。
本研究的目的是针对我国农产品小规模、分散式的产销特点，寻找一种简便、快速、灵敏、可靠、实用的市场果品蔬菜中常见农药残留的快速检测方法。研究内容及结果如下：
（1）对乙酰胆碱酯酶的测活方法进行优化，并对影响测活的因素进行了研究，改进了乙酰胆碱酯酶的测活体系和有关参数，即：AChE酶液50μL（1个固定化酶片），底物碘化硫代乙酰胆碱50μL，显色剂双二硝基苯甲酸50μL，pH8.0缓冲液2.9mL（固定化酶测活时加入3.95mL），终止剂1%SDS1mL（固定化酶测活时不用）。
（2）通过对5种固定化材料的研究，筛选出固定乙酰胆碱酯酶的合适材料为硝酸纤维素膜，并对固定化的参数进行了探索和优化：载体材料浸泡48h，戊二醛浓度0.005%，牛血清白蛋白浓度0.5%，缓冲液pH值6.0，固定化温度4℃，固定化时间12h，最终酶活回收率可达到31.03%。每批次固定化酶活力变异系数均小于4.04%，各批次之间标准差为0.028，变异系数为4.16%。每批次及各批次间固定化酶精密度良好，即该固定化方法重现性较好。
（3）对硝酸纤维素膜固定化AChE酶的特性进行了研究，并与游离酶特性进行了比较，结果表明：固定化乙酰胆碱酯酶对底物的最适反应温度为45℃比游离酶提高5℃，最适pH为8.5比游离酶提高了0.5个pH单位。对农药的灵敏度比游离酶有所提高，保存期限比游离酶大大提高，4℃保存一个月活力仅损失4.6%，活力保存率为相同条件下游离酶的43倍。
（4）建立了固定化乙酰胆碱酯酶目测法快速检测农药残留的方法，并自制了显色片。操作步骤为：固定化酶片浸于提取液中，常温下抑制10min，取出酶片置于载玻片上，同时放上对照酶片，在酶片之上放置显色片，并滴加底物50μL，放入恒温培养箱35℃反应5min，取出载玻片，置于白色滤纸上观察结果。对29种常见农药的最低检测限在0.2～5mg/kg之间。
（5）建立了固定化乙酰胆碱酯酶的比色法，对水样中8种农药在0.00156～2mg/kg浓度范围之间线性关系良好（r＞0.9584），对有机磷农药和氨基甲酸酯类农药检测的灵敏度为0.00625～0.0625mg/kg，远低于各农药对应的MRL值。
（6）用固定化乙酰胆碱酯酶进行了实际样品检测，目测法除对多菌灵、抗蚜威之外，对其他农药残留均呈阳性；比色法回收率均高于85%，变异系数在2.96%～5.21%之间，本方法准确度、精密度均较好，且不受提取液颜色的影响。
（7）两种检测方法与气相色谱进行比较，都拥有较好的符合率（目测法为75%，比色法为100%），且其操作简单、省时、不需要贵重的仪器，检测费用较低，可用于现场的快速检测。