● 摘要
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科（Labiatae）鼠尾草属多年生草本植物，具有活血祛瘀，通经止痛，清心除烦的功效，在临床上被广泛应用于心脑血管疾病、癌症及各种炎症的治疗。近年来，丹参作为植物次生代谢途径研究的理想材料，被誉为“模式药用植物”。鉴于传统中药以水煎服的用药方式，以迷迭香酸和丹酚酸B为代表的水溶性酚酸类成分被认为是丹参发挥药效的主要活性物质，受到研究者们的普遍关注。
由于丹参水溶性酚酸类成分与木质素代谢共有苯丙烷代谢通路，本研究以丹参为实验材料，以丹参木质素合成关键酶基因——肉桂酰辅酶A还原酶SmCCR和丹参咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶SmCCoAOMT——为研究对象，采用分子生物学和代谢组学的技术，对其在丹参酚酸类成分积累，木质素合成中的作用，进行了研究，所得结果如下：
1. 利用DNA walking，RT-PCR和PCR克隆了2个CCR基因和1个CCoAOMT基因，并利用生物信息学对其进行了功能分析和结构预测。系统进化树分析发现， SmCCR1和SmCCR2与其他物种来源的CCR均具有较高的同源性，而SmCCR1和SmCCR2具有较远的遗传距离。实时荧光定量PCR结果表明，SmCCRs和SmCCoAOMT基因在丹参各组织均有表达，SmCCR1主要在叶中表达，SmCCR2和SmCCoAOMT主要在茎中表达；其表达还受到MeJA和病原菌XC-1等多种因素的诱导。
2. 利用DNA walking进一步克隆了SmCCR1和SmCCoAOMT的1.2 kb和1.3 kb的5’侧翼序列，PlantCare分析其顺式作用元件，发现除含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子区域的必须元件外，还有MYB结合位点（MYB binding site），胁迫响应元件，激素响应元件等一系列作用元件。在此基础上，构建了SmCCR1启动子与AtPAP1融合的GUS表达载体，利用烟草注射，瞬时表达系统，验证SmCCR1启动子与AtPAP1的相互作用，结果表明：GUS基因在【AtPAP1+P:SmCCR1】中表达量高，推测AtPAP1对P:SmCCR1有直接的激活作用。
3. 构建过表达拟南芥AtPAP1转录因子同时干涉SmCCR1表达载体，利用叶盘法转染丹参，获得14个转基因株系。HPLC测定转基因株系丹酚酸B，迷迭香酸含量均有显著性提高；与此同时木质素含量显著降低，植株矮化；总酚酸，总黄酮较对照也有显著提高。
4. 构建了RNA干扰的SmCCoAOMT载体，并转染获得了11个转基因株系，其中有7株的CCoAOMT表达量较对照有明显的下调。后期总木质素，木质素单体，水溶性丹酚酸B，迷迭香酸，总酚，总黄酮检测正在进行中。
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