● 摘要
目的：肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，化疗是治疗肿瘤的重要手段，肿瘤细胞的多药耐药性（multidrug resistance, MDR）是化疗失败的主要原因之一。肿瘤细胞过度表达P糖蛋白（P-gp）是引起MDR的一个重要原因。而P-gp也是MDR逆转剂开发的重要靶标。灵芝是担子菌纲灵芝属真菌，在我国有悠久的药用历史，常被用作化疗时的辅助药物，以提高机体免疫功能和增强自身的抗癌能力。麦角甾醇是灵芝中重要的甾醇类物质，具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老等多种生理活性。本实验主要研究灵芝取物对人胃癌SGC7901/ADR细胞多药耐药的逆转作用，并探讨其可能的逆转机制，为开发灵芝中肿瘤多药耐药逆转剂提供一定的理论和实验依据。
方法：
1 细胞毒性及逆转活性的测定
以MTT法测定灵芝乙酸乙酯部位（GE）、正丁醇部位（GB）、麦角甾醇（Erg）、灵芝乙酸乙酯部位用大孔树脂分离的60%乙醇解吸部分（GER）对SGC7901/ADR细胞的细胞毒作用，计算出非毒性剂量，以非毒性剂量的各药物组作为逆转剂，用MTT法检测药物对SGC7901/ADR细胞的逆转作用，计算逆转倍数，并通过MTT法测定SGC7901/ADR细胞对ADR、VCR、DDP的耐药倍数。
2 罗丹明和阿霉素的蓄积以及P-gp表达的检测
用流式细胞仪检测各药物作用SGC7901/ADR细胞后，细胞内的罗丹明蓄积和阿霉素蓄积的变化；通过间接免疫荧光标记法测定，各药物作用SGC7901/ADR细胞后，细胞内P-gp表达的变化。
3 RT-PCR检测细胞中MDR1基因的转录
通过RT-PCR方法检测SGC7901细胞和SGC7901/ADR细胞中MDR1基因转录在各药物处理后的变化。
4 灵芝乙酸乙酯部位的初步分离
用大孔树脂D101对灵芝乙酸乙酯部位进行初步分离
5 活性部位（GE、GB、GER）的高效液相色谱（HPLC）检测
用HPLC法对灵芝不同活性部位中活性成分的进行指纹图谱分析，确认该活性部位的特征信息
结果：1细胞毒性实验结果：我们选择对SGC7901/ADR细胞杀伤小于20%的剂量作为非毒性剂量。阳性：维拉帕米Ver(5 µg/mL)、非毒性剂量的GE（20 µg/mL、100 µg/mL）、GB（4 µg/mL、20 µg/mL）、Erg（1 µM，5 µM）和GER（4 μg/mL，20 μg/mL）作用SGC7901/ADR细胞的逆转倍数分别为4.23、3.71、4.53、2.64、2.12、3.92、4.84、3.33、3.64；
2 GE（20 µg/mL、100 µg/mL）、GB（4 µg/mL、20 µg/mL）、Erg（1 µM，5 µM）和GER（4 μg/mL，20 μg/mL）能够增加胃癌耐药细胞SGC7901/ADR细胞内Rh123和ADR的蓄积。通过间接免疫荧光标记法测定，流式细胞仪检测SGC7901/ADR细胞内P-gp的表达。结果显示；敏感细胞组阴性组相比下降了56.0%，GE（20 µg/mL、100 µg/mL）、GB（4 µg/mL、20 µg/mL）、Erg（1 µM，5 µM）和GER（4 μg/mL，20 μg/mL）作用后，荧光蓄积量分别下降了21.5%、32.7%、20.5%、27.8%、20.4%、32.7%、29.4%、37.0%。
3 RT-PCR的结果显示，GE（20 µg/mL、100 µg/mL）、GB（4 µg/mL、20 µg/mL）、Erg（1 µM，5 µM）和GER（4 μg/mL，20 μg/mL）处理细胞后，MDR1基因的转录分别下降了32.16%、50.27%、25.34%、41.53%、36.56%、57.63%、24.69%、50.18%。
4 HPLC图谱显示，灵芝乙酸乙酯和正丁醇部位的图谱峰非常相似，共有12个图谱特征峰，其中12号峰是标品麦角甾醇，其相对含量分别为1.70%和1.91%。
结论：灵芝乙酸乙酯部位、灵芝正丁醇部位、麦角甾醇和GER能够下调SGC7901/ADR细胞中MDR1基因和P-gp的表达，可以增加SGC7901/ADR细胞内Rh123和ADR的浓度，从而部分逆转人胃癌耐药细胞SGC7901/ADR的多药耐药，有可能成为新的以P-gp为靶点的逆转剂。
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