题目：靶向性细胞Caˉ2+荧光探针的合成及其应用

细胞内游离Caˉ2+作为细胞内第二信使，具有重要的生物学功能。因此， 细胞内游离Caˉ2+的浓度和时空分布的研究已成为化学、生物学和基础及临床医学等 学科重要的前沿热点研究课题。目前，细胞内游离Caˉ2+的研究主要借助先进的荧光 图像分析技术和Caˉ2+荧光探针来实现的，但迄今为止，尚未见既可长波激发、又与 Caˉ2+结合后荧光峰有位移、可无损伤的导入细胞、且对胞内Caˉ2+测定具有双靶向胜、 可同时对胞质Caˉ2+和胞核Caˉ2+进行测定的整体性能优良的Caˉ2+荧光探针及其应用的 研究报道。 本论文的研究主要开展了以下几个方面:1.合成了新型Caˉ2+荧光探针STDBT的 AM酯型STDBT-AM，使该探针可无损伤性的导入细胞。2.系统研究了新型Caˉ2+ 荧光探针STDBT的光谱性能包括吸收光谱、荧光光谱、荧光寿命和荧光量子产率;6 种不同类型细胞标记性能和它在四种不同的活性氧体系中的耐氧化性能。3.以所合成 的STDBT-AM为细胞Caˉ2+荧光探针，采用共聚焦技术，进行了不同类型细胞受刺激 之后胞内游离Caˉ2+浓度变化的实时监测，探讨了细胞内游离Caˉ2+动员的机制，并与 Fluo-3进行比较。 本研究论文主要包括以下三个部分: 一概述 本文对目前常用的凡种细胞Caˉ2+测定方法，特别是钙荧光指示剂法中细胞Caˉ2+ 荧光探针的合成研究及测定方法进行了较为详尽的综述。 二.新型细胞Caˉ2+荧光探针STDBT－AM的合成及其性能研究 1.新型Caˉ2+荧光探针STDBT－AM的合成 将合成的具有靶向性、可长波激发、与Caˉ2+结合前后荧光峰有较大位移的新型 Caˉ2+荧光探针STDBT制成AM酉旨型导入细胞。 2.新型Caˉ2+荧光探针的性能研究 系统研究了所设计合成的Caˉ2+荧光探针STDBT的分析性能，包括吸收光谱、荧 光光谱、细胞荧光标记特性和耐氧化性能。结果表明，所合成试剂STDBT既具备双 波长Caˉ2+荧光探针Fura-2与Caˉ2+结合前后吸收和荧光峰有位移，又保持了长波长Caˉ2+ 荧光探针Fluo-3荧光激发波长位于可见光区的特性且与Caˉ2+的亲和力较小，适合细 胞Caˉ2+的动态测定。同时细胞荧光图像分析显示，STDBT-AM进入细胞后既标记 胞质又标记胞核，且胞核、胞质边缘界限清晰明显，是目前唯一的可以AM酯型无 损伤导入细胞、双波长、可见光激发、具有亚细胞区域定位性的人工合成小分子cw+ 荧光探针。并且其水溶性好，在细胞内较Fluo-3等更易于负载，耐氧性较目前常用 的两种Caˉ2+荧光探针Fura-2和Fluo-3好，氧化剂对STDBT与Caˉ2+的亲和力的影响 较小。试剂整体性能优于目前国内外广泛采用的Caˉ2+荧光探针。 三.新型Caˉ2+荧光探针的应用 1.新型Caˉ2+荧光探针STDBT测定血清中游离Caˉ2+ 利用指示剂STDBT在PH=7.2的中性缓冲介质中，可与c扩+络合形成稳定的络 合物，且络合前后吸收峰有较大位移这一特点，建立了一种在生理条件下，采用双 波长比率法测定血清中游离Caˉ2+的新方法。 2.肾上腺素诱导不同运动负荷大鼠心肌细胞胞质、胞核Caˉ2+的动员机制研究 采用激光共聚焦显微术，应用所合成的新型Caˉ2+荧光探针STDBT--AM研究了 肾上腺素诱导大鼠心肌细胞Caˉ2+动员的机制，探讨了心肌细胞胞核Caˉ2+与胞质Caˉ2+ 的调节是否具有独立性，并比较了不同运动负荷大鼠心肌细胞内Caˉ2+的含量、分布 变化情况，且与Fluo--3进行了比较。表明所合成探针STDBT-AM是目前国内外 唯一的可以AM酉旨型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的双靶向性的C犷+荧光 探针，肾上腺素诱导心肌细胞中核［Caˉ2+］_n。是通过T型Caˉ2+通道促进外Caˉ2+内流。 I STDBT用于瘦素对生长激素细胞胞内Caˉ2+变化的影响 将所合成的新型Caˉ2+荧光探针STDBT-AM用于生长激素细胞，研究了减肥药 一瘦素对细胞中Caˉ2+浓度的影响，并与Fluo-3-AM对生长激素细胞的标记及其对胞 内游离Caˉ2+浓度变化的响应等特性进行了比较。结果表明，与Fluo-3不同，新型Caˉ2+ 荧光探针STDBT对胞核Caˉ2+具有很强的靶向性，当它与Fluo-3一起标记细胞时它能 完全占有细胞核，但却不进入核仁，是一种真正的胞核Caˉ2+荧光探针，且其荧光发 射峰位于长波长区域，它发射的为红色荧光。对瘦素诱导的胞内游离Caˉ2+浓度变化 的响应较Fluo-3更灵敏迅速。 4.双靶向性Caˉ2+荧光探针STDBT-AM用于K562细胞胞核Caˉ2+和胞质Caˉ2+ 的调节机理研究 利用新型Caˉ2+荧光探针STDBT AM的双靶向性，结合激光共聚焦技术研究了 K562细胞胞核［Caˉ2+］_n和胞质［Caˉ2+］_n内。的调节机制。结果表明在K562细胞中胞核Caˉ2+ 和胞质Caˉ2+在行使其信使作用时具有相对独立性，激动剂诱导胞质[Caˉ2+]_c的升高主 要来自外Caˉ2+内流和内Caˉ2+释放，而胞核［Caˉ2+］_n升高主要依赖于内Caˉ2+释放，即核 被膜紧邻外周的内Caˉ2+释放和被认为是核Caˉ2+库的核被膜空腔的内Caˉ2+释放。