● 摘要
金属硫蛋白（Metallothioneins，MTs）是一类低分子量的能够被金属诱导表达的特异性蛋白，这类蛋白与重金属离子有着强亲和力，在生物解除重金属毒性过程中起着重要作用，因此在环境研究中经常作为评价重金属污染的生物标志物。目前，人们已经研究出了多种检测MTs的方法，其中电化学方法由于重复性好、敏感度高、操作便捷等特点尤其受到人们的重视。尽管如此，目前常用的电化学方法往往不能有效地消除进行生物样品中MTs检测时的干扰，使得检测值往往偏离真实值。此外，对典型的水生受试生物大型水蚤而言，MTs在多金属共存的暴露体系下的解毒机制还有待探索。
因而，本文首先在El Hourch等人研究的方波阴极溶出伏安法（SWCSV）基础上，分析大型水蚤MTs的电化学方法测定中的干扰因素，从而改良此法进行定量分析。接着，模拟了金属离子进入细胞内与MTs发生络合反应的过程，通过电化学法研究了不同金属与MTs的络合性质。最后，在多金属共存的暴露体系下，在以上的研究成果的基础上，进一步探索大型水蚤内MTs的解毒机制。主要研究成果如下：
（1）本文首次发现了某类无机阴离子在SWCSV检测生物样品中MTs时会导致检测值偏低。此类无机阴离子需满足两个条件：1、在样品溶液中大量存在；2、能够与Hg2+生成某种不溶物。然而在了解这类离子的干扰机制后，研究发现降低测试温度可以显著降低这种干扰效应。接着，通过增加对样品的加热时间、改变电化学测试时的富集电位，可以进一步降低样品中大分子蛋白的干扰。在此基础上，我们得到了改良的SWCSV检测方案，既保留了原法检出限低（pM）的优点，又提高了检测结果的准确性。
（2）通过电化学法研究大型水蚤体内MTs与金属离子（Pb2+、Cd2+、Cu2+）的络合性质发现，MTs对Cd2+的亲和力显著要高于Pb2+及Cu2+，在Cd2+存在的情况下，将极大影响MTs上结合金属的形态分布，但并不是MTs上所有的结合位点都对Cd2+都存在极高亲和力。部分结合位点表现出极强的亲和力，然而剩余的结合位点亲和力较弱，并且此类位点与Cd2+的络合稳定常数也并不一致。与之相比，MTs与Pb2+的络合稳定常数基本为一常数，也就是MTs所有的结合位点对Pb2+不存在选择性的亲和。值得注意的是，Cu2+与MTs的亲和力虽然并不强，但可能会改变MTs的构型，提高MTs结合Pb2+的络合容量。
（3）MTs在重金属解毒过程中的迁移转化可能比螯合金属发挥更大的作用。对大型水蚤而言，MTs解除金属毒性的机制可能是螯合细胞内自由态的金属离子后转运到溶酶体中，此后MTs被酶解释放出金属离子，金属离子生成更稳定的化合物进而被排出体外。此外，暴露实验中发现Cu2+可能会提高MTs转运、排出Pb2+的效应，这也与此前模拟实验中发现Cu2+与MTs络合后会提高MTs结合Pb2+的络合容量结果相一致。