● 摘要
乳腺癌已成为威胁女性健康的主要恶性肿瘤。在传统手术、放疗和化疗的基础上，乳腺癌的治疗出现了内分泌疗法、生物及物理治疗等多种探索。外科手术疗法在一定程度上能有效地提高患者的生存率，但局部复发率比较高，对患者形体的创伤比较大，影响美观并且容易造成长期的心理阴影。放疗和化疗往往具有一定的局限性，同时伴随很大的毒副作用。内分泌和生物疗法也存在着严重的并发症、安全性比较差和治疗后的护理比较复杂等问题。因此，探索乳腺癌临床治疗的新方法和技术是当前生物医学亟待解决的重大问题。
光动力学疗法(photodynamic therapy, PDT)是一种肿瘤新疗法，利用一定波长的光激活富集在肿瘤细胞内的光敏剂，产生具有生物、化学活性的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)成分，从而杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤组织生长。目前PDT已应用于皮肤癌等浅表肿瘤的治疗，但由于光在生物组织中的穿透能力较差，限制了PDT对深部肿瘤的治疗。声动力学疗法(Sonodynamic Therapy, SDT)是指用一定频率和强度的超声激活富集在肿瘤部位的声敏剂，产生抗肿瘤因子，抑制肿瘤生长。由于超声的可聚焦性、穿透性和照射部位的选择性，SDT在一定程度上弥补了PDT的不足，对一些深部肿瘤有一定的疗效。在PDT和SDT的基础上，近年逐步开展起来声/光敏剂介导的声光动力学联合疗法(Sono-Photodynamic therapy, SPDT)的研究，目前声光联合疗法抗肿瘤方面的报道很少，但均表明其抗癌效果显著高于任何一种单独疗法。
二氢卟吩e6（Chlorin e6, Ce6）是一种源自天然叶绿素的单体四吡咯化合物，具有较强的光敏活性和声敏活性，Ce6介导的PDT和SDT均有一定的抗肿瘤效应。Ce6具有无毒、水溶性好，肿瘤组织高选择性富集以及非肿瘤组织清除率高等优点，正在发展成为一种新型高效的光/声敏剂。本研究是在前期工作基础上，以国家科研项目为依托，选择小鼠乳腺癌4T1为细胞模型，Ce6为声敏剂，频率为1.0MHz的平场超声以及激发波长为650nm，输出功率密度为10.4mW/cm2的半导体激光器为辐照光源，研究Ce6介导的声光联合疗法（Ce6-SPDT）杀伤4T1细胞的死亡模式及其机制，为SPDT诱导乳腺癌细胞死亡的细胞生物学机制及其临床应用提供部分实验数据：
1. Ce6在4T1细胞中的富集特性及定位研究：实验通过流式细胞仪检测了Ce6在4T1细胞中的代谢规律，发现在同一Ce6浓度下，加药后4h内，Ce6进入细胞中的含量随孵育时间延长逐渐增多，在孵育时间为4h时达到最大富集量；相同孵育时间下，细胞对Ce6的吸收随浓度增加而增加，孵育时间超过4 h后，细胞内的Ce6含量基本不增加或者增加缓慢，维持在一个相对稳定的状态。实验结果提示，Ce6与细胞共孵育4h可能是进行SDT/PDT处理的最佳时间。采用激光共聚焦显微镜观察Ce6的亚细胞定位，结果表明，Ce6主要定位于4T1细胞的线粒体，提示线粒体可能是SDT/PDT损伤的主要靶细胞器之一。
2. Ce6介导的声光联合疗法（Ce6-SPDT）杀伤4T1细胞的实验参数筛选：研究了Ce6浓度、光照和超声处理时间，以及超声处理强度对4T1的细胞毒作用。实验结果表明，在所选的浓度范围内，Ce6对4T1不具有细胞毒作用；Ce6-PDT处理时，细胞的相对存活率随Ce6浓度和光照处理时间的增加而下降，在光辐照剂量1.2J/cm2的条件下，1μg/mL可能是Ce6-PDT损伤4T1细胞的Ce6浓度阈值。在超声频率为1.0MHz时，细胞对超声具有一定的辐照时间和强度依赖性；Ce6的加入增强了超声的杀伤作用，本研究选择Ce6-SDT处理对细胞基本没有损伤的1 minute辐照时间和0.36W/cm2强度作为超声处理参数。在所选的实验参数下，Ce6介导的声光联合疗法(Ce6-SPDT)对4T1细胞具有一定的协同杀伤效应。
3. Ce6-SPDT诱导4T1细胞死亡效应的研究：主要研究Ce6-SPDT诱导4T1细胞死亡的模式（实验参数为：1μg/mLCe6，强度0.36W/cm2的超声处理1minute，光辐照总剂量1.2J/cm2）。①扫描电子显微镜观察到Ce6-SPDT处理后细胞表面起泡现象。②采用荧光显微镜、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜和Western blotting技术检测Ce6-SPDT处理后4T1细胞凋亡的发生。DAPI 染色显示细胞核出现明显的损伤；Annexin V-PE/7-AAD荧光双染结合流式细胞仪检测发现，Ce6-SPDT显著地提高了凋亡率；PI冻染、彗星电泳结合流式细胞仪检测显示，Ce6-SPDT处理后DNA片段化显著增强、DNA严重受损伤；RHO123结合流式细胞仪检测到线粒体膜电位显著下降；激光共聚焦显微镜观察显示Ce6-SPDT处理后Bax转定位到线粒体，细胞色素C释放到细胞质；Western blotting分析显示Ce6-SPDT处理后凋亡相关蛋白Bcl-2表达降低，Bax基本维持不变，Caspase-3、PARP出现明显的剪切片段。实验结果提示Ce6-SPDT触发4T1细胞Caspase依赖性细胞凋亡，可能有线粒体途经参与。③通过荧光显微镜、基因转染以及Western blotting、激光共聚焦显微镜检测了Ce6-SPDT处理后4T1细胞自噬现象的发生。MDC染色检测到细胞自噬小体的形成增多；转染EGFP-LC3的4T1细胞经Ce6-SPDT处理后出现更多的绿色荧光斑点聚集区域；Western blotting检测Ce6-SPDT处理后自噬相关蛋白的表达，发现LC3由I型向II型发生了明显的转换，Beclin-1的表达明显增强；激光共聚焦显微镜显示在Ce6-SPDT处理后，线粒体与ATG5共定位，LC3和Lamp2共定位。这些结果提示Ce6-SPDT可能触发4T1细胞自噬。
4. Ce6-SPDT对4T1细胞的其它敏感靶点的损伤：①超声处理后检测到荧光大分子FD500在细胞内的含量升高，HO-PI双染观察到Ce6-SPDT处理后PI染色明显增强，提示细胞膜的完整性破坏，超声处理增强了细胞膜的通透性。②流式细胞仪检测Ce6-SPDT处理24h后，S期细胞周期阻滞程度明显增强。③细胞生物学行为的影响：体外损伤修复实验表明，Ce6-SPDT对4T1细胞具有明显的迁移抑制作用；克隆形成能力检测实验发现，Ce6-SPDT显著地抑制了4T1细胞的集落形成能力。结果提示，Ce6-SPDT诱导的4T1细胞损伤可能具有多位点效应。
5. Ce6-SPDT诱导4T1细胞的不同应答模式及其机制研究：通过检测细胞自噬抑制剂3-MA和细胞凋亡抑制剂Z-VAD-fmk对Ce6-SPDT诱导的细胞毒效应以及细胞凋亡、自噬的影响，对Ce6-SPDT作用的可能机制进行探讨。实验表明，自噬抑制剂3-MA可以抑制Ce6-SPDT诱导的4T1细胞自噬发生，增强细胞核损伤、Caspase-3活化和线粒体膜电位下降以及细胞死亡；Caspase抑制剂z-VAD部分抑制了SPDT引发的细胞毒和细胞凋亡，但对线粒体膜电位和细胞自噬没有明显的影响，也不能最终抑制细胞死亡。结果提示，细胞自噬在Ce6-SPDT中起保护作用，推测可能与自噬清除受损的线粒体，阻止细胞发生凋亡应答有关。
6. ROS在Ce6-SPDT诱导4T1细胞凋亡和自噬效应中的调控作用：Ce6-SPDT处理后4T1细胞内ROS显著升高，ROS清除剂NAC有效缓解了Ce6-SPDT诱导的ROS水平升高和细胞存活能力下降，同时可以部分抑制细胞凋亡，部分抑制线粒体膜电位降低和DNA片段化，提示细胞内ROS水平与细胞凋亡活性的变化可能有关；MDC染色发现，NAC几乎完全抑制了Ce6-SPDT诱导的4T1细胞自噬现象。实验结果表明，表明细胞内ROS可能是Ce6-SPDT引起4T1细胞线粒体损伤，诱导细胞凋亡的因素之一。总之，在Ce6-SPDT诱导的4T1细胞应答机制中，ROS可能同时参与凋亡和自噬过程的调节。