● 摘要
前言：微重力所致的肌萎缩是人类太空飞行中出现的严重问题之一。在早期太空飞行中研究者就注意到宇航员体重明显下降。一方面这是体液丢失的结果，另一个重要原因是肌质量下降。但是，微重力导致肌萎缩的分子机制尚不清楚。本课题主要研究太空飞行，模拟微重力和超重培养对秀丽线虫(C. elegans)体壁肌细胞结构和功能的影响，分析微重力导致肌萎缩的分子机制。实验方法：经过15天太空飞行/旋转模拟微重力或3天6.05 G超重处理后，对秀丽线虫生存率和运动能力进行观察，采用Real-time PCR技术检测了重要的五种肌相关基因表达，包括：抗肌萎缩蛋白基因（dys-1），螺旋-环-螺旋转录调节因子基因（hlh-1），肌球蛋白B重链基因（unc-54），L-型电压依赖性钙通道蛋白基因（egl-19），肌球蛋白A重链基因（myo-3)；应用荧光染色和Western Blotting方法检测了三种肌相关蛋白含量，包括：肌动蛋白（F-actin），肌球蛋白A（myosin A），致密体（dense-body）。结果和分析：从统计结果分析，处理组和对照组线虫生存率没有明显变化，这同以往研究结果相一致。此外，太空组和模拟微重力组动物显示出运动频率减慢，同时线虫在琼脂糖平板上zigzag爬行轨迹波高与宽比值下降，提示处理后出现了运动功能缺陷。这些结果均说明微重力可以导致线虫肌肉功能改变。而超重组线虫表现出运动亢进，zigzag爬行轨迹波率（波高/波宽）增加。这些数据相对微重力组在相反方向揭示了力学影响对肌功能的作用。我们采用了免疫荧光染色法对线虫体壁肌重要的结构蛋白--肌球蛋白A（myosin A）和致密体（dense-body）进行了直接形态学观察。三个实验组动物的肌球蛋白荧光染色切片均显示肌细胞面积缩小，长度和亮度没有明显变化，为微重力和超重刺激下线虫会发生肌萎缩提供了直接的形态学证据。另外，与对照组相比，试验组线虫肌细胞中致密体显示线虫肌细胞大小结构没有明显变化，但是其荧光强度明显降低，提示致密体总量有所下降，表明肌细胞中细肌丝与其锚定点间的连接减少。但是，F-actin染色各组未见显著性差异。太空飞行组，模拟微重力组和超重力组Western blotting的结果更精确地显示了肌球蛋白A流失，进一步验证了力学处理后有肌萎缩发生。以上这些结果与以往太空和模拟微重力试验结果相一致。在太空飞行组和模拟微重力组，线虫体壁肌细胞dys-1表达显著增高，而hlh-1, unc-54, myo-3和egl-19 RNA水平在处理后下降。相反，在超重组，dys-1, unc-54, myo-3和egl-19 mRNA 则下调，但是hlh-1却表达上调。体壁肌变化主要发生在基因转录和蛋白翻译水平，并且本文所有检测均来自于整体动物，而不是像以往采自于单个细胞。讨论：众所周知抗肌萎缩蛋白所在的蛋白复合物DGC将细胞外基质与细胞内骨架相连，不断感知外环境力学刺激，指导肌组织作出适应性反应。我们的结果显示了编码DGC中抗肌萎缩蛋白基因dys-1的变化，揭示dys-1参与了骨骼肌力学信号传导，在微重力感知中有潜在作用。另一方面，Hlh-1属于肌源性调节因子家族(MRFs)，它主要控制两种肌球蛋白重链（MHC）异构体表达（MHC A 和B 分别由myo-3 和Unc-54编码）。Hlh-1变化会通过调节肌球蛋白重链表达导致肌萎缩，这在western blotting结果中也得到了进一步证实。egl-19 编码线虫L-型电压依赖性钙通道蛋白1亚基。egl-19基因沉默是致死性的，而其功能下降会引起肌收缩功能减弱，提示该离子通道蛋白在维持体壁肌收缩方面有重要作用。创新性成果：1）首次对经历不同力学刺激（太空飞行，模拟微重力，超重力）后线虫肌肉结构进行了直接的形态学观察，发现三组均出现肌萎缩。但是，超重组线虫肌萎缩机制不同于前两组，我们认为是超重刺激过大，导致了肌张力持续增高性肌萎缩。2）经历过力学刺激的线虫在运动行为上均出现了一定障碍，但是超重组在处理后表现为运动亢进，不同于微重和太空飞行后线虫的运动功能减弱。而且线虫在琼脂板上的爬行轨迹也显示了这两种不同刺激产生的后果有差异。3）在基因表达方面引人注目的是抗肌萎缩蛋白基因dys-1的变化。在太空飞行和模拟微重力组它明显增高，但在超重力组则降低。我们认为是：微重力下dys-1代偿性增加是为了探查到更多力学信号，在超重力下则相反。所以，我们认为任何生物体所需要的力学刺激应该有一个最适范围，力学信号感知系统在重力改变时会做出适应性变化，以便维持肌细胞正常的收缩舒张功能。但是本研究是迄今为止唯一一篇报道了在线虫体内力学刺激下dys-1基因变化的文章，所以其观点还有待更多研究证实。4）至于hlh-1, unc-54, myo-3变化基本说明了肌萎缩发生的基因调节机制。但有一个例外是超重力组虽然从形态学上检测到了肌萎缩，但是其hlh-1表达是上调的，分析认为这是两种调节共同作用的结果，由于在较大重力下线虫无法运动觅食，需要有更加强壮的肌肉组织抵抗重力运动，所以导致肌肉相关基因转录调节因子Hlh-1上调，但是线虫在这样大的重力下无法运动又导致了肌张力持续增高，触发了肌萎缩发生机制，所以unc-54和myo-3表达下调。5）egl-19基因表达在各组中均下调，说明其对肌萎缩发生的影响是促进作用，但它与前面三个基因影响肌肉结构不同，它是通过影响功能起作用的。6）Western blotting实验结果定量地显示了肌萎缩程度，在蛋白水平完善了肌萎缩发生的分子途径。