题目：MeV离子注入马鞍型剂量存活曲线产生机理的实验研究

离子束生物技术是一种新型的诱变技术，它是通过将低能重离子注入生物体内，来研究其生物学效应和作用机理，并将它用于遗传育种和基因工程等方面的一种综合技术。自离子注入在我国兴起以来，“马鞍型”的剂量与存活率关系一直都是最受瞩目的问题之一，但其机理的研究进展相当缓慢。经过近十几年的研究，“马鞍型”剂量-存活曲线的形成机理仍处在假设之中有待进一步的研究证实。本课题选择絮凝产生细菌C8作为出发菌进行MeV离子辐照处理，研究高注量的离子导致生物学特性的变化规律以及它们与马鞍曲线形成可能存在的联系；从分子生物学角度研究马鞍曲线上不同注量区域导致样品突变的差异，并通过实验结果解释马鞍型存活曲线产生的机制和原因。本课题为“马鞍型”剂量-存活曲线的形成机理提供实验数据，为离子注入微生物育种提供理论依据。本课题实验主要从如下几个方面展开：为确保离子注入以及后续试验的顺利进行，确定了离子注入之前的实验参数：细菌培养时间为10h；将制备菌膜的单细胞菌悬液改良为107个/mL；为达到离子注入机的真空度要求，将甘油浓度降低为4%。对出发菌株C8进行了3 MeV He2+离子注入实验，筛选得到了10株诱变菌株，分别对其进行了脱氢酶活性和絮凝率测定，并利用引物S28对絮凝率提高到80%以上诱变菌进行了RAPD分析。实验结果表明：3 MeV He2+离子注入的剂量-存活曲线为“马鞍型”，马鞍点对应剂量为1×1012 ions/cm2 和8×1012 ions/cm2；1A、1B、8A、8B为马鞍点处得到的诱变株；1A、3C、4B和8B脱氢酶活明显高于C8；90%的突变菌发生了正突变，其中1B、4B、8A、8B、10A的絮凝率达到了80%以上；RAPD图谱表明离子注入后絮凝率达到80%以上的诱变菌DNA发生了变化，其中1B、8B的条带增加。说明马鞍点处或接近马鞍点处突变株的脱氢酶、絮凝活性都表现较高；其RAPD扩增的条带也显现出较非马鞍点处的条带多的趋势。通过分别采用2 MeV He2+（4%、10%甘油保护），2 MeV He2+、3 MeV C2+、4.5 MeV C2+（均4%甘油保护）对C8进行注入，筛选得到31株突变株，并分别对所有突变株及出发菌C8的脱氢酶活性、絮凝率进行测定以及利用引物S15进行了RAPD分析。结果表明：4条剂量-存活曲线均为“马鞍型”，且各曲线马鞍点对应不同剂量；与C8相比脱氢酶活性明显提高的2a、3a、8a、3-(a)、4-(a)、4-(b)、3-A、4-A都是在马鞍点获得的；2 MeV He2+注入时8a絮凝率最高为79.40%，是在马鞍曲线峰值的诱变菌，3 MeV C2+、4.5 MeV C2+注入3-(b)、4-(c)、5-(a)、8-(a)、10-(a)、2-A、4-B、8-A、10-A达到了80%以上，其中3-(b)、4-(c)、8-(a)、5-(a)、10-(a)、4-B是马鞍点峰值或马鞍点相邻剂量区域得到的；RAPD结果说明离子注入处理后所有的诱变菌DNA都发生了突变，且马鞍点或靠近马鞍点的突变株的扩增片段增多。本研究首次提出马鞍型存活曲线是由DNA的多位点突变造成的结论，该结论与以往传统的在马鞍点处有修复作用存在的假设不符，分析其原因是马鞍点处DNA突变点较多，从而更大程度上改善了其生长特性，导致了马鞍点处存活率较高的结果的产生。