● 摘要
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科（Labiatae）鼠尾草属多年生草本植物，具有凉血消痈，通经止痛，除烦安神等功效，广泛用于心脑血管疾病的预防和治疗。丹参的主要活性成分包括脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物。近年来，随着丹参原药材市场的需求量日益增加以及药用植物现代化研究的不断发展，丹参的次生代谢产物的合成及其调控研究越来越受到人们的关注，丹参已成为研究药用植物次生代谢工程的理想材料，被誉为“模式药用植物”。
当植物受到生物或非生物的压力胁迫时，植物体内会大量积累脱落酸、水杨酸、茉莉酸（jasmonic acid，JA）等植物激素，这些植物激素再通过相应的信号转导系统可以诱导次生代谢产物的合成，以抵御外界刺激。茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）等植物激素对次生代谢产物合成的调控作用已被人们所认同，并广泛应用于促进植物中次生代谢产物积累等方面。丹参中的研究表明，茉莉酸的衍生物茉莉酸甲酯作为外源诱导子可促进丹参次生代谢产物的大量积累；利用基因工程技术既可提高丹参内源MeJA含量，也能促进多种次生代谢产物在丹参中的积累。目前，茉莉酸及其衍生物在模式植物拟南芥中的信号转导通路已较为清楚，jasmonate ZIM-domain（JAZ）蛋白为茉莉酸信号通路上的关键分子，与茉莉酸诱导的花青素合成，毛状体发生等均相关，在烟草中也有研究证明了JAZ蛋白在茉莉酸调控次生代谢产物尼古丁的合成及积累中具有重要作用， JAZ蛋白的发现为探索茉莉酸诱导丹参活性成分积累，提供了新的研究切入点及方向。鉴于此，本研究以茉莉酸信号途径关键分子JAZ蛋白为研究对象，采用基因工程技术，在证明SmJAZ蛋白参与了丹参茉莉酸信号转导通路的基础上，深入研究其在茉莉酸诱导丹参酚酸类成分积累中的具体功能，为药用植物次生代谢产物调控研究提供了新的方向和思路。
本研究的主要结果及结论如下：
1. 通过Blast比对分析本实验室已建立的丹参转录组数据库，获得2个有完整开放读码框（open reading frame，ORF）的JAZ基因及2个具有部分ORF 的JAZ基因序列，分别命名为SmJAZ1、SmJAZ8，SmJAZ2、SmJAZ3，相应的氨基酸序列分析表明4条丹参JAZ基因均包含有JAZ蛋白保守的ZIM结构域和Jas结构域。利用Real-time PCR进行器官表达模式分析表明，SmJAZs基因在根茎叶中花均有表达，除SmJAZ3在根中表达量较高，其它3条SmJAZs均在茎或叶中表达量较高。利用BD walking 的方法克隆了SmJAZ1和SmJAZ8基因的5’侧翼序列，分别长为1308 bp和2134 bp，Plantcare软件分析显示其启动子区包含有多种激素及胁迫相关顺式作用元件。实时荧光定量PCR的结果同样表明，SmJAZs基因的表达受到茉莉酸甲酯、机械伤害、脱落酸、赤霉素等多种因素的诱导。
2. Jas结构域普遍存在于JAZs蛋白中，为高度保守序列，是JAZ蛋白的活性功能区。构建过表达JAZ基因全长载体pJAZ1、pJAZ8，缺失JAZ蛋白重要功能区Jas结构域的截短型表达载体pSJAZ1、pSJAZ8，以及根据ZIM结构域和Jas结构域内的保守序列设计RNA干扰序列，构建JAZ基因家族干涉载体piJAZ、piCO-TJ。利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法转染丹参叶片，经DNA及RNA水平的检测，共获得转SmJAZ1基因全长的丹参高表达阳性株系（OEA）及转SmJAZ8基因全长的丹参高表达阳性株系（OEB）3个及4个，转SmJAZ1截短型序列的高表达阳性株系（OEAS）及转SmJAZ8截短型序列的高表达阳性株系（OEBS）各4个，以及5个干涉ZIM结构域的共干涉株系（ir）和4个干涉序列为保守区tify基序和Jas基序的共干涉株系（coir），为SmJAZs基因功能研究提供了良好的植物材料。
3. 通过分析野生型和转基因株系中总酚酸、总黄酮含量及抗氧化活性，结果显示：转SmJAZ8基因全长的阳性株系OEB总酚、总黄酮含量及抗氧化活性分别是对照的1.91~2.50倍、1.49~1.96倍及1.59~1.96倍；转截短型JAZ8基因阳性株系OEBS则与对照丹参没有显著性差异（P>0.05）；RNAi-JAZ干涉阳性株系ir总酚、总黄酮含量较对照均有显著的降低（P<0.05）。
4. 采用HPLC的方法检测30 d实生苗龄的阳性转基因株系中酚酸类成分变化，结果表明：OEB转基因株系根中丹酚酸B含量最高可达78.74 ± 1.48 mg/g，是同时期对照株系的1.4倍（P < 0.05）；而OEBS转基因株系根中酚酸类活性成分与同期对照株系无显著不同（P>0.05）。进一步通过实时荧光定量PCR的方法分析阳性株系中，丹参酚酸类活性成分生物合成途径上的PAL、C4H、4CL、RAS等关键酶基因的表达量变化，结果表明OEB转基因株系中这些合成途径上的相关基因均有不同程度的上调，而OEBS转基因株系中相关基因表达量变化不明显（P>0.05）。
5. 在培养基中添加外源MeJA，检测对照植株和转基因株系对MeJA的响应差异，通过分析生根水平、生长状态、JA响应基因表达量及次生代谢产物含量等多个茉莉酸响应事件，结果表明过表达JAZ8全长的OEB转基因株系表现出部分响应茉莉酸表型的缺失，包括茉莉酸对根生长的抑制作用减弱，茉莉酸响应基因表达量变化不明显，以及茉莉酸诱导的次生代谢产物合成减少等，使转基因丹参成为茉莉酸不敏感型植株，而缺失Jas结构域的截短型过表达转基因株系OEBS则表现出与对照类似的响应情况。
本研究通过多种转基因事件证明了，丹参JAZ基因可以负调控丹参茉莉酸信号途径，并且丹参JAZ蛋白中的Jas结构域是其参与调控茉莉酸信号通路的保守结构。同时，通过遗传转化的方法获得了次生代谢产物含量提高的转化植株，说明SmJAZ8基因的表达可促进丹参酚酸类物质的积累，证明了SmJAZs在丹参中的具体功能，推测SmJAZs对丹参次生代谢产物合成的正调控作用很可能是通过茉莉酸信号的转导来实现。因此，本研究为茉莉酸诱导药用植物中次生代谢产物积累提供了新的研究切入点，也为阐明丹参中茉莉酸信号途径及酚酸类合成途径的偶联奠定了基础。