● 摘要
甘肃鼢鼠(myospalax cansus)是我国西北黄土高原地区常见的有害啮齿动物,终身营地下洞道生活,由此发展出一系列适应低O2、高CO2及黑暗环境的结构和生理机制,是研究动物对低O2、高CO2适应极好的模式动物。目前,有关甘肃鼢鼠低氧适应与促肾上腺皮质激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、血液生理指标及血红蛋白α-珠蛋白基因间关系的研究未见报道。为探讨甘肃鼢鼠低氧适应的血液学机制及血红蛋白分子适应机制,用KX-21N全自动血液分析仪对甘肃鼢鼠低氧处理前后血象指标进行测定,采用SN-695A型智能放免r测量仪测定血清中ACTH浓度,运用分子生物学方法克隆测定甘肃鼢鼠血红蛋白α-珠蛋白基因序列,以期能够为研究甘肃鼢鼠生理及分子适应机制提供一些依据。研究得到了以下结果:
甘肃鼢鼠在低氧适应后血红蛋白浓度(hemoglobin concentration ,HGB)显著增加,且低氧程度愈大,增加愈多,O2浓度14.1%、10.5%和6.5%时HGB比常氧组有极显著升高(P﹤0.01),14.1%组与6.5%组有显著性差异(P<0.05);红细胞数(red blood cell,RBC)和红细胞压积(hematocrit,HCT)也随氧浓度降低而不断增加,不同氧浓度与常氧组相比均有极显著差异(P﹤0.01),14.1%组与10.5%组RBC和HCT有显著性差异(P<0.05),14.1%组与6.5%组间RBC和HCT有极显著性差异(P﹤0.01);平均红细胞体积(mean corpuscular volume ,MCV)在O2浓度14.1%和10.5%时升高,在O26.5%时稍降低,各组间无显著性差异;平均血红蛋白含量(mean corpuscular hemoglobin ,MCH)和平均血红蛋白浓度(mean corpuscular hemoglobin concentration ,MCHC)随氧浓度的减小出现了降低趋势,除O2浓度6.5%组与常氧组有显著性差异外,MCH其余各组间无显著性差异;MCHC 在O2浓度14.1%、10.5%和6.5%时与常氧组相比呈极显著性差异(P<0.01),O210.5%与6.5%组间MCHC有极显著差异(P<0.01),O214.1%组与6.5%组有显著性差异(P<0.05)。
血清ACTH浓度随低氧程度加剧明显升高,与对照组相比有极显著差异(P<0.01)。甘肃鼢鼠腹腔注射ACTH后, RBC、HGB和HCT与正常对照组相比极显著升高(P<0.01)。MCV轻微升高,但无显著性差异, MCH和MCHC与正常组相比均降低,MCH无显著性差异,而MCHC呈极显著性差异(P<0.01)。
注射ACTH后甘肃鼢鼠的HGB、RBC、HCT、MCV、MCH和MCHC等血液指标值与低氧14.1%、10.5%和6.5%组相比,ACTH组与O26.5%组HGB和RBC有显著性差异(P<0.05),ACTH组与14.1%、10.5%组MCHC有显著性差异(P<0.05),其余各血液指标值接近,无显著性差异(P>0.05)。以上结果说明低氧激活了甘肃鼢鼠下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(hypothalamo-pituitary-adrenalcortex,HPA),导致ACTH分泌增加,ACTH进一步刺激皮质酮分泌,皮质酮作用于红细胞,使得RBC、HGB、HCT含量增加,从而提高血液中红细胞的携氧能力以适应低氧生活环境。ACTH影响低氧刺激后血液中RBC、HGB及HCT生理指标的增加,ACTH在红细胞数目及血红蛋白含量增加方面起着重要的作用,但低氧下RBC、HGB及HCT的增加并不全由ACTH所引起的,随着低氧程度的加剧,甘肃鼢鼠逐步调动体内其它机制来进一步增加RBC和HGB的量以应对低氧。
通过克隆并测定甘肃鼢鼠血红蛋白α-珠蛋白基因序列,得到甘肃鼢鼠α-珠蛋白基因序列总长788bp,由3个外显子和2个内含子组成。利用DNAman软件对测序后拼接结果进行分析,推测甘肃鼢鼠α-珠蛋白基因氨基酸序列由140个氨基酸组成。分别比较甘肃鼢鼠与人(Homos spaiens)、高原鼢鼠(Myospalax baileyi)、鹿鼠(Peromyscus maniculatus)、高原鼠兔(Ochotona curzniae)、小鼠(Mus musculus)、家鼠(Rattus norvegicus)和以色列盲鼹鼠(spalax ehrenbergi)α-珠蛋白氨基酸序列,发现在人、鹿鼠、小鼠和家鼠α111位点处均发生氨基酸替换,高原鼠兔α90位点发生氨基酸替换,血红蛋白α链中这两个位点非常重要,α111是α1β1连接位点,α90是α1β2连接位点。甘肃鼢鼠α111Asn在人、鹿鼠、小鼠、家鼠中被替换,这是一个很重要的替换区域,在人类血红蛋白形成时,α111和β115是连接α1β1重要氨基酸残基,甘肃鼢鼠此位置发生变化,可能使α1β1之间氢键连接处发生脱节,导致氢键连接的构象结构发生改变,影响Hb连接氧气能力。甘肃鼢鼠α90位氨基酸在高原鼠兔中发生替换,说明此处氨基酸变化也影响了α1β2间连接,α1β2间氢键以及范得华力改变使血红蛋白四级构象发生变化。分别比较甘肃鼢鼠与人、高原鼢鼠、鹿鼠、高原鼠兔、小鼠、家鼠和以色列盲鼹鼠α-珠蛋白氨基酸序列,发现在人、高原鼠兔、小鼠、家鼠α35位均发生氨基酸替换,在人和高原鼠兔中是Leu→Cys,在小鼠和家鼠中是Ala→Cys,甘肃鼢鼠35位点氨基酸替换成Cys,Leu、Ala属于α-氨基酸,侧链无环,Cys为含硫氨基酸,甘肃鼢鼠中Cys的替换可能增加了其血红蛋白氧亲和力,原因是α35位为α1β1的连接位点,Cys侧链上二硫键可能改变了α-珠蛋白与其它亚基间的间隙,使得血红蛋白的四级构象发生改变,更加稳定,进一步增加了血红蛋白的氧亲和力。
甘肃鼢鼠72位Asn为其特有的氨基酸,在人、鹿鼠中由Ala→Asn,在高原鼠兔、家鼠中由Asp→Asn,在小鼠、盲鼹鼠中由Gly→Asn,Asn的替换可能增加了血红蛋白氧亲和力,甘肃鼢鼠114位Tyr也为其特有的氨基酸,在人、鹿鼠中由Leu→Tyr,在高原鼠兔、小鼠、家鼠和盲鼹鼠中均由His→Tyr, Tyr的替换也可能增加了血红蛋白氧亲和力,但是否真的会提高,将从模拟建立的甘肃鼢鼠血红蛋白三维结构上,进一步进行阐明。甘肃鼢鼠其它位点氨基酸改变对血红蛋白影响不大,不改变其与氧亲和力。
由甘肃鼢鼠α-珠蛋白的遗传距离图看出,甘肃鼢鼠与高原鼢鼠之间距离最小为0.0113,与鹿鼠距离次之为0.0939,与小鼠遗传距离为0.104,甘肃鼢鼠与家鼠及高原鼠兔遗传距离分别为0.1786和0.1840,与人遗传距离最远为0.2048,结果显示甘肃鼢鼠与高原鼢鼠的同源性较高,亲缘关系最近,与人的同源性较远。用ClustalX、MEGA3.1等生物信息学分析软件对甘肃鼢鼠、高原鼢鼠、高原鼠兔、鹿鼠、小鼠、家鼠和人编码核苷酸序列进行分子系统进化树的构建。由结果可以看出甘肃鼢鼠与高原鼢鼠处于一个分支,与高原鼢鼠进化关系最近,与人进化关系最远;家鼠与小鼠聚为一类后与鹿鼠在同一水平上聚类,然后这一类在与甘肃鼢鼠和高原鼢鼠聚成的一类在相聚;高原鼠兔与人聚为一类,二者进化关系较近。
α35、α111在高原鼢鼠中也发生氨基酸位点的改变,与人比较甘肃鼢鼠与高原鼢鼠氨基酸替换位点相同,都是Leu→Cys、Ala→Asn,高原鼢鼠与甘肃鼢鼠属地下啮齿动物,生活环境同为低氧高二氧化碳,此位点在两种地下鼠中发生相同变化,使得甘肃鼢鼠与高原鼢鼠的血红蛋白氧亲和力提高。血红蛋白α-珠蛋白基因序列发生改变,使得氨基酸种类相应也改变,甘肃鼢鼠α-珠蛋白一级结构发生变异使得亚基构象发生改变,亚基构象变化又使得血红蛋白分子整体构象发生改变,最终改变了血红蛋白与氧的亲和力,使其亲和力增加。甘肃鼢鼠与高原鼢鼠此位点均发生变化说明α35、α111位为低氧适应位点,此位点的变化是甘肃鼢鼠低氧适应的血红蛋白分子机制之一。
本研究测定甘肃鼢鼠α-珠蛋白基因序列,由基因序列推测出氨基酸序列,比较与其它几个物种α-珠蛋白基因氨基酸序列差异,甘肃鼢鼠α-珠蛋白基因核苷酸序列是解释其具有高血红蛋白含量及高氧亲和力的基础,说明甘肃鼢鼠α-珠蛋白基因差异可能是对严酷地下低氧环境的适应机制之一。