● 摘要
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科多年生草本植物，是我国沿用已久的大宗药材之一。水溶性的酚酸类化合物是丹参的主要药用有效成分之一。由于传统中药长期以来将药物经水煎煮制成汤剂后服用，水溶性成分发挥的功效更多，这也使得该类成分成为近年来研究的热点。其中，迷迭香酸(rosmarinic acid, RA)和下游产物丹酚酸B(salvianolic acid B, Sal B)都具有抗肿瘤、抗肝损伤和保护心血管等活性。因此，研究丹参迷迭香酸途径可以更合理的利用其药用资源，并有助于研究下游酚酸类物质的合成途径。文献报道丹参迷迭香酸合成途径可能与彩叶草相似，但具体的生源途径还不完全清楚，还需进一步研究。该途径上的SmPAL、SmC4H、Sm4CL、SmTAT等酶基因功能已被研究的较为清楚，但目前还没有SmHPPR和SmRAS蛋白活性研究的相关报道。
将植物次生代谢途径相关基因整合进微生物中，以工程菌作为生物反应器，异源发酵生产植物次生代谢产物(Plant secondary metabolic products, PSMPs)的方法已经比较成熟。该方法弥补了传统植物提取和化学合成的不足，不需要大量的植物材料或繁琐的合成步骤，就可以生产大量具有天然构象的PSMPs，且成本低、效率高。因此，本研究旨在通过毕赤酵母(Pichia pastoris)异源表达药用植物丹参的关键酶SmHPPR和SmRAS，并且检测SmHPPR蛋白活性，进而在体外对丹参的迷迭香酸代谢通路进行研究。此外，通过基因工程技术构建了SmTAT、SmHPPR和SmRAS三基因串联共表达的酵母工程菌，以期为日后在酵母中异源生产迷迭香酸奠定基础。
本研究得到的结论如下：
1）从丹参中克隆得到SmTAT、SmHPPR和SmRAS的开放阅读框(ORF)，分别长1236 bp、942 bp和1284 bp。成功构建了SmHPPR融合6×HIS的胞内单表达载体pPICZB-SmHPPR和胞外单表达载体pPICZαA-SmHPPR，以及SmRAS融合6×HIS的胞内单表达载体pPICZB-SmRAS和胞外单表达载体pPICZαA-SmRAS。
2）优化电转化条件，当电转杯间距1 mm、电压750 V、单个脉冲0.4 ms、脉冲25次时，毕赤酵母X-33的转化效率最高，转化率为1.57×102。共得4个空载菌株，3个SmHPPR重组菌株，4个SmRAS重组菌株。本研究中，优化蛋白诱导条件，SmHPPR的最适pH为6.5，最佳甲醇添加量为0.5%。丹参SmHPPR蛋白条带在70 kDa左右，以二聚体形式存在。SmRAS蛋白只在pH7.0表达，诱导时最佳甲醇添加量为0.5%。SmRAS蛋白纯化得到两个条带，分别为70 kDa左右和80 kDa左右，推测可能在表达过程中受到了不同程度的糖基化修饰。
3）HPLC检测SmHPPR酶反应产物，发现反应液中几乎检测不到添加的底物4-羟基苯丙酮酸，但没有检测到预期的产物4-羟基苯乳酸。推测可能生成新的未知产物或者该蛋白在表达过程中部分未正确折叠，虽然能够与底物结合，但未能释放底物生成产物。
4）通过三表达框和2A自剪切序列两种方法设计载体构建策略，获得三基因共表达载体pPICZB-SmRAS-SmTAT-SmHPPR-3K和pPICZB-SmHPPR-SmRAS-SmTAT-2A。转化酵母X-33，采用不同的载体构建方法获得了含有酪氨酸支路关键酶基因SmTAT、SmHPPR和SmRAS的重组酵母菌株。通过HPLC检测，发现一个保留时间为18.3 min的新产物，推测丹参迷迭香酸代谢通路与彩叶草可能不完全相同，在SmHPPR和SmRAS之间可能还有其他的合成步骤。
本研究在毕赤酵母中成功异源分泌表达了SmHPPR和SmRAS蛋白。通过两种方法构建工程菌，得到含有丹参迷迭香酸途径酪氨酸支路关键酶基因SmTAT、SmHPPR和SmRAS的重组酵母菌株，并检测到重组菌株中有新的未知产物生成，为以后进一步具体研究迷迭香酸代谢通路提供重要的信息，为后续探索迷迭香酸的异源合成奠定基础。本研究采用新的思路研究丹参水溶性酚酸类成分，为其异源生产提供依据，为大规模产业化生产酚酸类药用成分提供可能。