题目：hACTB-hFⅦ杂合基因座的构建及在HEK293细胞中表达的鉴定

凝血因子Ⅶ(FⅦ)是凝血过程中重要的辅助因子，并且是外源性凝血途径的第一蛋白酶，在Ca2+的作用下和组织因子结合转变为活化的凝血因子FⅦ（FⅦa）并启动凝血。
凝血因子Ⅶ活性的变化对败血症伴休克、高血脂症、心脑血管病及肝脏疾病的防治与预后判断有一定的临床意义，凝血因子Ⅶ既可以有效地纠正肝病患者凝血异常，也可以治疗血友病，它的原料为人源性血浆，而血浆极为短缺的形势使得目前凝血因Ⅶ一药难求，延误了某些患者的治疗，甚至危急到某些患者的生命。即使目前国内凝血因子Ⅶ严重不足，我国出于安全考虑并不打算解禁进口血液制品，目的是为了避免血液来源的潜在病毒传染。因此，利用哺乳动物细胞系生产重组人类凝血因子Ⅶ不仅对上述问题的解决具有积极作用，也为人类凝血因子Ⅶ大规模的生产提供了一条可选择的途径。
获得凝血因子Ⅶ稳定高效表达的关键是构建高效表达载体，本实验室已利用鼠WAP-人LF杂合基因座在小鼠乳腺中获得了高效表达，因此我们选择人肌动蛋白（ACTB）的调控区构建人ACTB-人FⅦ杂合基因座以期能获得高效表达人类凝血因子Ⅶ的哺乳动物细胞系。
ACTB基因属于管家基因，在所有细胞中处于活跃的表达状态，并保证其表达产物的功能。它的产物是维持细胞基本生命活动所必需的，其表达水平受环境因素影响较小，几乎在各个生长阶段的个体大多数组织中持续表达，即使有变化，也是很小的。除RNA聚合酶与启动子或启动序列相互作用对其有影响之外，它的表达不受任何机制调节。
本实验首先构建了一个能进行连续三次基因抓捕的载体，其中含有进行基因抓捕的6个无痕连接的同源臂。同源臂5和6用于从含hACTB基因座的细菌人工染色体（hACTB BAC）上第一次亚克隆10 Kb的hACTB基因3′完整侧翼序列；同源臂3和4用于从hFⅦ BAC上第二次亚克隆13 Kb的从起始密码子（ATG）到终止密码子（TAG）hFⅦ基因组序列；同源臂1和2用于从hACTB BAC上最后亚克隆10 Kb的hACTB基因5′完整侧翼序列。经过PCR扩增、限制性内切酶消化和序列测定验证，我们成功地构建了一个全长约50 Kb的hACTB-hFⅦ杂合基因座。
然后我们利用核转染技术，将表达载体电击到人胚肾细胞HEK293的细胞核中，观察其表达情况。首先，提取转染后细胞的基因组DNA，进行PCR鉴定，检测杂合基因座是否整合到细胞基因组中；再提取转染后细胞的总RNA，进行RT-PCR鉴定，检测杂合基因座是否正确转录凝血因子Ⅶ；最后通过ELISA测定重组人类凝血因子Ⅶ在HEK293细胞中的表达量。
经过加压筛选后获得稳定转染凝血因子Ⅶ的细胞克隆，经PCR及RT-PCR鉴定发现，细胞克隆中hFⅦ-hACTB杂合基因座成功地整合到了宿主HEK293细胞中的染色体基因组上，并进行了正确转录，ELISA结果显示：阳性细胞克隆中表达了重组人类凝血因子Ⅶ的表达量为：7.74 ng/ml。
因此我们首次证明了hACTB基因的调控区可作为hFⅦ基因的调控序列并指导其在HEK293中的表达。为探索大载体在哺乳动物细胞系的高效表达以及大规模制备具有重要价值的药物蛋白奠定了重要的工作基础。