题目：Luminex液相芯片技术检测六种虫媒病毒方法的研究

虫媒病毒又称节肢动物病毒，是指可以在敏感的节肢动物蜱、蚊、白蛉、蠓等吸血昆虫体内繁殖但不致病，通过吸血昆虫叮咬将病毒传播给人畜引起严重疾病的一组病毒。虫媒病毒种类多样，目前世界上已发现的虫媒病毒537种，已证实其中130余种对人畜有致病性。我国幅员辽阔，地理环境复杂，媒介生物众多，存在多种虫媒病毒。另外，随着国际交往的日益频繁，境外虫媒病毒病传入我国的可能性也显著增加，因此，高通量、快速、准确地检测虫媒病毒的感染对于虫媒病毒病的防治具有重要的意义。
液相芯片技术作为一种高通量的检测技术，是20世纪90年代中期由美国（Luminex）公司发展起来的。该技术集流式细胞技术、荧光编码微球、激光、数字信号处理和传统的生化技术于一体，是一种多功能的分析平台，它可以实现对多指标同时进行定性、定量分析。具有高通量、灵敏度高、重复性好、节省样品的特点。目前，液相芯片技术在病毒检测中的应用主要集中于检测病毒核酸或抗体，但对直接检测病毒抗原研究较少。本研究以森林脑炎病毒、日本乙型脑炎病毒、西尼罗热病毒、东方马脑炎病毒、辛德比斯病毒、登革热病毒六种虫媒病毒为研究对象，将特异性单克隆抗体偶联到不同的荧光微球上，利用免疫学经典方法“双抗体夹心”的技术原理，建立能同时快速检测以上六种病毒的液相芯片多重检测技术平台，为虫媒病毒的检测与鉴定提供一种新方法。
本课题首先制备特异性的单抗。将杂交瘤细胞免疫小鼠并收集腹水，利用蛋白A/G纯化柱进行纯化。然后，利用双抗夹心ELISA方法对实验室所保存的虫媒病毒特异性单抗进行筛选配对,分别筛选出可灵敏检测病毒抗原的捕获抗体和检测抗体；进而进行液相芯片检测方法的建立和优化。将捕获抗体偶联荧光羧基微球后，与病毒灭活抗原共同孵育以特异捕获病毒抗原，进而加入生物素标记的检测抗体，孵育后加入SA-PE孵育，利用Luminex200系统检测荧光信号后进行结果分析。在方法建立过程中，本研究对偶联微球及检测条件进行了摸索和优化，进而对该方法的检测灵敏度、可重复性和特异性进行了评估。
通过多次重复实验，摸索出偶联微球（106个）的最佳抗体量是20µg。验证液相芯片技术捕获抗原、结合检测抗体及SA-PE孵育的-最佳反应时间分别为1.5h、45min、15～30min，SA-PE的最适检测用量为1：100。将β巯基乙醇灭活的WNV、JEV、SINV、EEEV、DENV培养液分别进行系列稀释以摸索该技术的检测灵敏度。结果显示，TBEV灵敏度可达25PFU，WNV、JEV灵敏度可达195.31 PFU。取多种无关抗原及病原体（BSA、肠道病毒71、黄热病毒、A型流感病毒、基孔肯亚病毒、呼吸道合胞病毒、西部马脑炎病毒、B型流感病毒）确定该技术方法的检测特异性，结果表明，无关抗原及病原体检测孔均未出现阳性信号，表明该检测系统具有很好的特异性。重复3次实验，结果显示各个平均荧光强度值的变异系数(CV)均在6%以内，说明该检测系统有很好的稳定性。通过与传统-ELISA进行比较，结果显示液相芯片检测六种病毒的灵敏性高于ELISA法，特异性与ELISA结果一致。
为了确定该检测方法对多种病毒混合感染的检测效果，将六种病毒混合后作为拟检测抗原，生物素化检测抗体的工作溶液为含六种相应标记抗体的混合物。结果显示，六种病毒的偶联微球检测结果均出现强的阳性荧光信号，而其它微球检测结果没有出现阳性信号，微球之间也无交叉反应，证明该技术可用于多种病毒混合感染的检测。通过多次重复试验，批间变异系数均小于9%，表明该检测方法具有很好的稳定性。
虫媒病毒是一类广泛存在且危害严重的病毒，目前国内外鲜有用液相芯片方法对虫媒病毒进行检测与鉴定的报道。本研究利用特异性单克隆抗体，采用双抗夹心方法的原理，建立能对六种虫媒病毒进行种水平鉴定的液相芯片技术，为虫媒病毒的检测与鉴定提供一种高通量的新方法，用于早期快速确定病原体。对于临床救治、流行病学调查都将具有重要意义。