题目：中介蝮（Gloydius intermedius）蛇毒磷脂酶A2的分离纯化及生物活性研究

蛇毒磷脂酶A2（Snake venom phospholipase A2，svPLA2）是蛇毒中毒性最强的组分，除具有酶活性外，还可能具有多种毒理学活性，具有潜在的利用价值。同一种毒蛇的蛇毒中可能存在多种PLA2，虽然它们的氨基酸序列和空间结构相似，一级结构差异不大，但功能上却差异明显，因此是研究蛋白质结构和功能的极好模型，也是蛇毒研究领域的一个热点。
中介蝮（Gloydius intermedius）为蝰科蝮亚科（Crotalinae）毒蛇，广泛分布于我国西北、华北地区，是我国6种蝮蛇中毒性最强的一种，其PLA2的结构及作用的分子机制有待阐明，而分离获得PLA2是解决这些问题的前提。
本研究的内容及结果：
1．中介蝮蛇毒PLA2的分离纯化
（1）以中介蝮粗毒为原料，用Sephacryl-200HR凝胶过滤层析柱进行初步分离，用50 mmol/L 醋酸铵缓冲液洗脱，分离得到8个蛋白峰（Peak1-8）。以获得的峰组分1mL腹腔注射昆明小鼠，观察急性毒性效应，并采用SDS-PAGE分析组分的蛋白纯度。结果表明，Peak1和Peak8蛋白含量甚微，无致死活性。Peak2、Peak6和Peak7虽然有小鼠致死活性，但是没有引起偏瘫和呼吸衰竭，而且有出血，推测可能为出血毒素。Peak3、Peak4、Peak5有致死活性，且能引起偏瘫及呼吸衰竭，可能为神经毒素。SDS-PAGE分析发现这3个组分都非单一条带，因此需要进一步分离。
（2）用HiTrap Q阴离子交换层析对具有神经毒性的Peak3、4、5进一步的分离纯化，上样后以A液（50 mmol/L 醋酸铵缓冲液，pH7.8）洗脱未结合的组分，之后从A液到100%B液（50 mmol/L醋酸铵缓冲液，0.5 mol/L NaCl pH7.8）进行线性梯度洗脱。收集各洗脱峰及穿透峰，然后取各组分1mL腹腔注射昆明小鼠，根据急性毒性结果判定神经毒素活性，用SDS-PAGE分析组分纯度。结果表明， Peak3-1、Peak4-1和Peak5-2有致死活性，且局部有出血，其可能为出血毒素。Peak3-2、Peak4-2、Peak5-1均有致死活性，且可导致偏瘫及呼吸衰竭，为神经毒素，由于SDS-PAGE分析发现不是单一条带。
（3）最后，利用HiTrap SP阳离子交换柱对有PLA2神经毒活性的3个峰组分（Peak 3-2、Peak 4-2、Peak[1] 5-1）进行了分离，上样后以A液（50 mmol/L 醋酸铵缓冲液，pH5.5）为起始洗脱液，之后从A液到100% B液（50 mmol/L醋酸铵缓冲液，0.5 mol/L NaCl pH5.5）进行线性梯度洗脱，收集各洗脱峰。腹腔注射昆明小鼠，观察急性毒性效应，同步用SDS-PAGE分析组分纯度，卵磷脂琼脂平板法检测致死毒性组分的PLA2活性。结果表明，Peak3-2-2、Peak4-2-1、Peak4-2-2和Peak5-1-2无致死活性，Peak3-2-1和Peak5-1-1均有致死活性，Peak3-2-1分子量在14kDa左右，纯度接近单一条带，Peak5-1-1仍有三个条带，不纯。Peak3-2-1、Peak5-1-1都具有磷脂酶A2活性，其中Peak3-2-1的PLA2活性最高。
2．生物活性初步检测：
（1）酶活性检测：以中介蝮蛇粗毒做阳性对照，卵磷脂琼脂平板法检测了Peak3-2-1组分的PLA2酶活性，结果显示Peak3-2-1比粗毒的透明圈大。
（2）抑菌活性检测：以大肠杆菌为对象，粗毒为阳性对照，PBS为阴性对照，检测Peak3-2-1组分的24h抑菌效应，粗毒组出现的抑菌圈明显，而Peak3-2-1组分的抑菌活性不高。
（3）溶血活性检测：以粗毒为阳性对照，红细胞血红蛋白释放法测定毒素的溶血活性，发现Peak3-2-1组分可以引起溶血，但活性比粗毒低。
（4）以SD大鼠的膈神经-肌肉接头标本为模型，电生理学方法检测了Peak3-2-1的突触阻断效应，发现Peak3-2-1 20min后就可以抑制间接刺激诱发的膈肌收缩，60 min后膈肌收缩下降到只有正常幅度的10 %左右。而且Peak3-2-1对间接刺激诱发的大鼠膈肌收缩有抑制作用，但不影响直接刺激膈肌引起的肌肉收缩，说明它抑制的是神经-肌肉接头的传递，而对肌肉组织本身无明显影响，其作用部位在突触间隙，因此属于神经毒素。
结论：采用凝胶过滤层析和离子交换层析技术，从中介蝮蛇粗毒中筛选分离得到了一种具有神经毒性的PLA2，其分子量大约为14 kDa，该PLA2具有溶血活性、无抑菌活性。本工作为下一步研究中介蝮PLA2的分子进化及作用机理奠定了基础。




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