● 摘要
超过20种人类疾病与蛋白质或多肽淀粉样纤维化密切相关，例如帕金森病，家族性血管淀粉样变性，溶菌酶淀粉样变性疾病，最近发现一些与疾病不相关的蛋白质和多肽，如溶菌酶、胰岛素等在一定的条件下同样可以自组装形成淀粉样纤维，探究影响蛋白质的结构稳定性及其淀粉样纤维化的环境条件具有重要意义。
本文采用牛胰岛素作为模型蛋白质，探究了Na2SO4对蛋白质淀粉样纤维化的作用。实验结果表明，不同浓度的Na2SO4对胰岛素淀粉样纤维化过程具有不同的影响，低浓度条件下可促进纤维化，较高浓度可明显抑制淀粉样纤维的形成，更高的浓度则使胰岛素形成非纤维状聚集体。ANS荧光分析结果表明，所有浓度的Na2SO4均可减小胰岛素聚集体的表面疏水性，使聚集体对细胞膜的损害作用降低。Na2SO4的上述作用可能与其改变蛋白质分子间的静电作用力及溶剂效应有关。Na2SO4对溶菌酶淀粉样纤维化具有相同的作用。另外，本文还就几种阴离子和抑制剂对蛋白质纤维化的影响进行了探索和研究。
实验主要方法和结果
一、不同浓度的Na2SO4溶液对胰岛素和溶菌酶淀粉样纤维化过程的影响
分别向胰岛素和溶菌酶中加入不同浓度的Na2SO4溶液进行孵育，采用荧光探针和圆二色谱技术测定蛋白质淀粉样纤维的形态和构象变化，如ThT（Thioflavin T）荧光检测β折叠、ANS(1-anilino- naphthalene 8-sulfonate)荧光检测表面疏水区改变情况。实验结果表明，纤维在生长过程中，蛋白质的β折叠结构增加，疏水区域外露，其纤维生长曲线呈“s”型，具有成核-延伸-形成纤维的动力学特征。圆二色谱结果表明，随着蛋白质的β折叠增多α螺旋含量降低，不同浓度的抑制剂对蛋白质纤维化的影响不同。透射电子显微镜的结果表明，硫酸钠能够改变蛋白质聚集体的形貌。采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术检测胰岛素纤维对细胞膜蛋白的作用，胰岛素聚集体的形貌改变，其细胞毒性也有所降低。对溶菌酶淀粉样纤维同样采用ThT荧光技术检测溶菌酶纤维的生长过程，并采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)技术对纤维进行检测，实验表明不同浓度的硫酸钠对溶菌酶淀粉样纤维化过程的影响与胰岛素纤维化的作用相同。
二、几种酸根离子对胰岛素淀粉样纤维化的作用
将不同酸根离子的钠盐加入到胰岛素溶液中共同孵育，采用ThT荧光探针技术检测胰岛素淀粉样纤维化，比较不同阴离子对胰岛素淀粉样纤维化过程的影响。实验结果表明，同一离子强度的硝酸根对胰岛素淀粉样纤维化促进作用最强，而硫酸根离子对胰岛素纤维化的作用却不同与硝酸根，这一作用取决于浓度的大小。
三、一些化合物与硫酸钠共存时对溶菌酶纤维化的影响
采用荧光探针技术ThT检测溶菌酶淀粉样纤维化。检测不同物质与硫酸钠共存时对溶菌酶淀粉样纤维化过程的影响。实验结果表明，对苯二酚、聚乙二醇、谷胱甘肽单独存在时溶菌酶淀粉样纤维化受到抑制，在Na2SO4溶液与溶菌酶的混合溶液中分别加入对苯二酚、聚乙二醇、谷胱甘肽后，仅有抑制作用产生，二者无协同作用。采用高效液相色谱技术检测加入谷胱甘肽的样品，发现其结构在抑制纤维生长时没有发生变化，说明谷胱甘肽对溶菌酶淀粉样纤维化的抑制作用与其还原性无关。
结论：在高温和低pH条件下孵育溶菌酶和胰岛素，可形成成熟的淀粉样纤维，纤维形态具有密集的网状结构。加入不同浓度的硫酸钠后，蛋白质的淀粉样纤维化过程发生变化，低浓度促进纤维化，较高浓度抑制纤维化，更高浓度则使蛋白质形成非纤维状聚集体。硝酸根对胰岛素纤维化具有促进作用。另外几种化合物与硫酸钠同时做抑制剂，实验结果表明，对溶菌酶淀粉样纤维化的影响不同于硫酸钠单独存在时的影响，二者抑制溶菌酶淀粉样纤维化。