题目：T4多聚核苷酸激酶活性和抑制的荧光分析研究

T4多聚核苷酸激酶(polynucleotide kinase, T4 PNK)是由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，可催化核酸5′羟基端进行磷酸化，与核酸的重组、复制、修复息息相关，在分子生物学过程、药物开发、癌症诊断等方面具有重要作用。因此，有关T4 PNK的研究已经引起科研工作者们的广泛关注，而发展简单、可靠检测T4 PNK活性的方法是重要的研究方向之一。本文旨在发展均相、快速检测T4 PNK活性的新方法，基于DNA磷酸化反应所引发的不同信号转换方式，建立了三种快速、灵敏检测T4 PNK活性及研究酶抑制剂的荧光法。
本文的主要研究内容可归纳为以下三个方面：
一、基于酶辅助信号放大研究T4 PNK的活性及抑制
基于lambda核酸外切酶(λ exo)对磷酸化DNA的特异性切割，以发夹型核酸探针和分子信标为识别探针与信号探针，建立了一种酶辅助信号放大研究T4 PNK活性及抑制的荧光法。T4 PNK催化发夹探针5′羟基端磷酸化，λ exo沿5′到3′方向高效地水解磷酸化发夹探针的茎部释放出引发链。此引发链可与分子信标环部互补杂交，破坏分子信标茎-环结构，使得荧光基团与猝灭基团远离，荧光信号恢复。限制性内切酶Nt.BbvCI可特异性地切割杂交双链中的分子信标链释放出引发链，使得引发链依次与其它分子信标杂交，实现循环杂交反应，荧光信号累积放大。基于酶辅助信号放大，可灵敏检测T4 PNK活性，检出限为1.0×10-4 U/ml。通过考察抑制剂的结果表明该方法还可用于研究酶抑制剂。因此，该方法为研究T4 PNK活性及抑制提供了一种快速、简单的新途径。
二、基于光诱导电子转移研究T4 PNK的活性及抑制

基于脱氧鸟苷与荧光染料发生光诱导电子转移(PIET)，以3′末端标记羧基荧光素的DNA(FDNA)为信号探针，以FDNA与其互补链cDNA形成的双链DNA为识别探针，建立了一种研究T4 PNK活性及抑制的荧光法。无PNK时，双链DNA不会被lambda核酸外切酶(λ exo)切割。此时，cDNA中5′末端富含的脱氧鸟苷与荧光染料靠近发生PIET，FDNA的荧光被G碱基猝灭。在T4 PNK存在下，λ exo可将磷酸化的双链DNA沿5′到3′方向切割，使得荧光染料与脱氧鸟苷远离，荧光信号恢复。基于T4 PNK催化双链DNA磷酸化前后荧光强度的变化，可实现对T4 PNK活性的检测。不同抑制剂对于T4 PNK活性的抑制效率表明，该方法可用于T4 PNK抑制剂的研究。因此，该方法可简单、低成本、快速地检测T4 PNK活性和酶抑制剂。
三、无需标记研究T4 PNK的活性及抑制
基于lambda核酸外切酶(λ exo)对磷酸化DNA的特异性切割，以荧光染料SYBR Green I (SGI)为信号分子，建立了一种无需标记、简单、快速检测PNK活性的荧光法。SGI自身荧光信号很低，但当与双链DNA(dsDNA)结合后荧光信号显著增强。在λ exo存在下，无T4 PNK时，SGI的荧光信号没有发生变化。T4 PNK 存在时，λ exo沿5′到3′方向水解磷酸化的dsDNA，使得SGI从dsDNA中脱落引起荧光信号降低。根据SGI荧光信号的变化可实现对PNK活性的检测。通过考察二磷酸腺苷、硫酸铵和磷酸氢二钠对T4 PNK的抑制结果表明，该方法可用于简单、快速、高选择性地检测PNK活性及酶抑制剂。