● 摘要
蛋白激酶(protein kinase)又称蛋白质磷酸化酶(protein phosphakinase)，是一类催化蛋白质发生磷酸化反应的酶。当共反应物三磷酸腺苷(ATP)存在时，蛋白激酶能够把ATP上的γ-磷酸转移到蛋白质分子的氨基酸残基上。在大多数情况下，这一磷酸化反应发生在蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上。蛋白激酶催化的蛋白质磷酸化过程是生物体内调节和控制蛋白质活力和功能的最基本、最普遍、也是最重要的机制，在细胞信号转导的过程中起重要作用。蛋白激酶的活性异常会导致各种疾病发生，如肿瘤、阿尔茨海默病等。人类基因中有超过500种蛋白激酶的基因，并且约有25%的药物研发集中于蛋白激酶抑制剂的筛选。所以，精确地测定蛋白激酶的活性及抑制剂的筛选不仅对以蛋白激酶为标靶的药物研发有价值而且对探究信号传导过程中基本的生物过程有重要意义。
电化学发光(Electrogenerated chemiluminescence，ECL)是指在电极上施加一定的电压使溶液中各组分之间或电极反应产物与溶液中某组分间进行化学反应而产生的一种光辐射现象。电化学发光生物传感器是将肽、酶、抗原/抗体、DNA等作为特异性识别物质，电化学发光物质为信号物质的分析器件。由于其灵敏度高、选择性好、装置简单等优点，在分析化学的研究领域中有着非常重要作用，在蛋白激酶的研究中也逐渐受到人们的关注。用多肽作为分子识别物质，与蛋白质相比，具有分子量小、易于合成、价格低廉，并且具有高的亲和性，极强的生物活性，可在极端条件下使用等优点，在生物分析检测中受到人们越来越多的关注。
本论文提出以肽为蛋白激酶的特异性底物分子，电化学发光试剂为信号物质，并分别以金纳米粒子和蛋白A为信号物质载体，构建简单、高灵敏、通用型的电化学发光肽生物传感器，并将其应用于蛋白激酶的分析检测及抑制剂的筛选。论文分为两部分：第一部分为引言部分，第二部分为研究报告部分。
第一部分为引言，首先介绍了蛋白激酶的定义和分类，简单综述了蛋白激酶的底物肽在生物传感器方面的应用；然后分别综述了蛋白激酶的几种检测方法，重点综述了基于电化学发光技术检测蛋白激酶的方法；最后提出本论文的研究目的和研究内容。
第二部分为研究报告部分，由以下两部分组成：
一、通用型电化学发光肽生物传感器检测酪蛋白激酶II的活性及抑制剂的筛选。该研究工作以特异性肽(CRRRADDSDDDDD)为分子识别物质，酪蛋白激酶II(CK2)为目标物质，钌联吡啶标记的金纳米粒子(Ru(bpy)32+-AuNPs)为巯基通用型的电化学发光物质，建立了一种高灵敏检测酪蛋白激酶II的电化学发光分析方法。将带正电的钌联吡啶和带负电的金纳米粒子通过静电相互作用形成信号物质Ru(bpy)32+-AuNPs，以AuNPs作为信号物质的载体，能够加快电子的传递速度，增强电化学发光信号，从而提高检测的灵敏度；巯基和金纳米粒子表面的特异结合，可广谱识别巯基磷酸根，从而实现通用型检测。将酪蛋白激酶II的底物肽通过巯基自组装固定到金电极表面，在γ-s-三磷酸腺苷存在时，酪蛋白激酶II(CK2)能将肽链上的丝氨酸位点磷酸化，生成硫代磷酸化的肽，基于硫代磷酸化的肽能与信号物质Ru(bpy)32+-AuNPs通过Au-S键共价结合，在共反应试剂存在下，产生电化学发光。增加的电化学发光强度与CK2浓度在0.01 U/mL～0.5 U/mL范围内呈良好的线性关系，检出限为0.001 U/mL。该方法具有灵敏度高，步骤简单等优点。这种简单、灵敏的生物传感器将在相关的临床样品中检测蛋白激酶的活性及抑制剂筛选方面有着巨大的潜能。
二、通用型电化学发光肽生物传感器检测蛋白激酶A的活性及抑制剂的影响。本工作以蛋白激酶A(PKA)为模型，以肽(CLRRASLG)为PKA的特异性识别物质，钌联吡啶衍生物Ru1标记的蛋白A(Ru1-pA)为抗体通用型电化学发光探针，建立了一种通用、灵敏的电化学发光检测PKA的分析方法。底物肽通过巯基自组装固定在金电极表面，制得传感器；该传感器在目标蛋白激酶和三磷酸腺苷存在下，发生磷酸化作用，生成磷酸化的肽，磷酸化的肽能通过抗磷酸丝氨酸抗体和蛋白A间的免疫反应将电化学发光探针固定到传感器上，进行蛋白激酶A的电化学发光检测。电化学发光强度的增加与蛋白激酶A的浓度在0.005 U/mL～0.5 U/mL之间呈良好的线性关系。检出限为0.003 U/mL。该方法通用性强、灵敏度高，为多通道同时检测多种蛋白激酶和抑制剂的筛选提供了一个思路。
本论文以肽为底物，以酪蛋白激酶II和蛋白激酶A作为目标分析物，以金纳米粒子和蛋白A为载体，构建了两种高灵敏、通用型的电化学肽生物传感器，建立了检测酪蛋白激酶II和蛋白激酶A的电化学发光分析方法。该方法对生物传感器和分析化学的发展具有重要意义，在临床诊断和治疗多种疾病及药物的研发方面也有着很大的应用潜能。