● 摘要
中介蝮（Gloydius intermedius）属于蝰科蝮亚科（Crotalinae）毒蛇，广泛分布于我国西北及华北地区。其蛇毒富含多种蛋白质及酶，对其研究在治疗毒蛇咬伤、临床医学及药物开发等方面具有重要意义。
蛇毒丝氨酸蛋白酶（Snake Venome Serine Proteases，SVSPs）是存在于蛇毒中的一种具有重要作用的蛋白水解酶，包括纤溶酶原激活剂(Plasminogen activator)、蛇毒纤维蛋白（原）溶酶、蛇毒类凝血酶（Snake venom thrombin-like enzyme）、蛋白C激活物、蛇毒凝血因子V激活剂、蛇毒凝血因子X激活剂、蛇毒血小板聚集激活剂7种，能广泛作用于血液凝结、血栓系统，能够影响凝血、促进血小板凝集、溶解血栓等。另外SVSPs之间在结构和蛋白序列上具有高度的同源性，但不同种类在外结合位点（exosite）具有不同的结构，因此它们具有各自特异性的底物并且表现出特定的生物活性。由于SVSPs在血液凝集，血栓溶解方面的作用，对其蛋白结构和功能活性的研究也就显得十分重要，也是研制出新的治疗心血管疾病药物的前提。
本实验通过凝胶过滤层析和离子交换层析技术，从中介蝮蛇毒分离纯化获得了丝氨酸蛋白酶GI-SP2，并对GI-SP2的生物学活性进行了表征。
实验的具体内容和结果如下：
1. SVSP的分离纯化：
（1）凝胶过滤层析：用葡聚糖聚丙烯酰胺凝胶Sephacryl-200HR装柱，以PH为8.0的50mmol/L碳酸氢铵（内含0.15mol/L NaCl及0.2g/L的叠氮钠）作为缓冲液，对中介蝮蛇粗毒进行分离，得到五个蛋白峰（P1-P5）。对分离得到的五个蛋白组分用Na-苯甲酰-DL-精氨酸-对硝基酰胺盐（N-benzoyl-D，L-arginine-ρ-nitroanilide，BApNa）为底物进行活性鉴定，结果显示P2、P3、P5三个组分具有明显的BApNa水解活性，其中P2的活性最高；SDS-PAGE电泳分析发现P2不是单一条带，需要进一步的分离纯化。
（2）阴离子交换层析：利用HiTrap DEAE-FF阴离子交换层析预装柱对P2组份做进一步的分离纯化，整个体系以PH均为8.0的A液（50 mmol/L 碳酸氢铵）、B液（50 mmol/L碳酸氢铵缓冲液，0.5 mol/L NaCl）作为缓冲液，流速为0.2 mL/min。上样后先用A液洗脱未与层析柱结合的蛋白，待穿透峰出来后，然后从A液到B液（100%）进行蛋白组分梯度洗脱。收集不同洗脱时段的峰组分，分别用底物BApNa检测其丝氨酸蛋白酶活性，结果表明P2-3、P2-4和P2-5组分都能作用于BApNa，P2-4的活性最高；对峰P2-4进行SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，显示P2-4不是单一条带，混有杂蛋白，仍然需要进一步的分离纯化。
（3）阳离子交换层析：利用HiTrap CM阳离子交换层析预装柱对阴离子交换所得P2-4组份进行再一次的分离纯化，体系以PH均为4.5的A液（50 mmol/L醋酸钠）、B液（50 mmol/醋酸钠，0.5 mol/L NaCl）作为缓冲液，流速控制为0.2mL/min。上样后用A液洗脱未与层析柱结合的杂质，待穿透峰出来后，然后从A液B液（100%）设置梯度洗脱蛋白。最终得到两个蛋白峰，用BApNa为底物对其进行活性鉴定，发现P2-4-1活性明显高于P2-4-2；对P2-4-1进行SDS-PAGE电泳检测，发现P2-4-1为单一条带，表明获得了目的蛋白GI-SP2。
2. 对分离纯化得到的SVSP进行生物活性检测
(1) GI-SP2对特异性底物BApNa的水解活性。
(2)测定抑制剂对GI-SP2的酶活性的影响：在GI-SP2中分别添加β-巯基乙醇（β-Mercaptoethanol，β-ME）、苯甲基磺酰氟 (PhenylmethanesμLfonyl fluoride，PMSF )、乙二胺四乙酸 (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA)，设不添加抑制剂组为阳性对照，通过超微量微孔板分光光度计测定GI-SP2与特异性底物BApNa的反应。数据显示GI-SP2对BApNa的水解活性可被PMSF显著抑制，EDTA对其活性无影响。表明GI-SP2不是蛇毒金属蛋白酶，属于SVSPs。
(3) GI-SP2对纤维蛋白原（Fg）水解活性：GI-SP2组分和纤维蛋白原混合，取不同时间段的产物进行SDS-PAGE检测，发现GI-SP2主要水解纤维蛋白酶的β链。
(4)小鼠尾巴流血时间测定：实验选择昆明系小鼠，给其尾静脉注射0.3μg/g的GI-SP2，以生理盐水为对照。结果表明GI-SP2能够使小鼠尾部静脉的流血时间得到明显的延长。
(5)小鼠出血活性测定：实验选择昆明系小鼠，设置不同的GI-SP2剂量梯度，利用皮下注射的方式处理生理状况相同的昆明系小鼠，待24h后处死，剥下其背部皮肤，检查是否有出血现象产生。结果显示注射GI-SP2剂量高达50μg的小鼠，其皮下都没有血斑出现，说明分离所得的GI-SP2无出血活性。
(6)类凝血酶活性：将分离所得GI-SP2与纤维蛋白原溶液均匀混合，置于37℃培养箱培养，设置凝血酶为阳性对照，观察有无白色沉淀的生成。结果表明，GI-SP2不是类凝血酶，它不能使纤维蛋白原溶液凝结。
(7)纤溶活性：利用纤维蛋白原平板的方法，鉴定所得组分GI-SP2是否具有纤维蛋白活性。结果显示，GI-SP2可以水解纤维蛋白，具有纤溶活性。
关键词：中介蝮；蛇毒丝氨酸蛋白酶；层析；生物活性
相关内容
相关标签