题目：黑胫钩额螽的转录组及线粒体基因组研究

黑胫钩额螽（Ruspoils lineosa）隶属于直翅目、螽斯总科、草螽科，在全国各地分布广泛。目前关于黑胫钩额螽的研究主要集中在外部形态及分类系统方面的研究，而有关黑胫钩额螽线粒体基因组及其转录组方面的研究却未见报道。为构建螽亚目昆虫进化树、开展螽亚目昆虫线粒体基因组、转录组学研究以及螽亚目昆虫个体生长发育和性别分化分子调控机制的探索，本研究选用黑胫钩额螽为研究对象，首先采用长PCR与二次PCR相结合的技术对黑胫钩额螽的线粒体基因组进行了测序，然后采用HiSeq™ 2000测序平台分别对黑胫钩额螽的雌、雄成虫的转录组进行了测序，对测序所得的数据经初步处理后，进行组装、注释及生物信息学全局分析。具体分析工作主要包括分析线粒体基因组的结构功能，预测及分类蛋白质的功能，筛选该物种雌、雄成虫之间的差异表达基因，并寻找出与该物种的个体生长及性别分化有关的差异表达Unigene，并对Unigene的相关功能及其参与的代谢通路、信号转导途径进行初步分析、线粒体转录组作图及分析等。研究获得的主要结果如下：
（1）线粒体基因组研究结果：黑胫钩额螽线粒体全基因组的长度为15,231bp，线粒体基因组A+T含量71%。蛋白质编码基因的起始密码子大部分都是典型的三联体密码子ATN，终止密码子大部分都是TAA。22个tRNA基因的长度分布在64~74bp。除tRNASer-AGN缺失DHU臂外，剩余的21个tRNA均能够形成典型的三叶草结构。2个rRNA中，LrRNA基因长度为1,325bp，SrRNA基因长度则为885bp。LrRNA基因的二级结构是由6个结构域和47个茎区组成的，SrRNA基因的二级结构是由3个结构域和33个茎区组成的。线粒体基因组的AT富集区位于SrRNA和tRNAIle基因之间，其序列长度为290bp，A+T含量为76.2%。联合22个物种构建的系统发育树显示黑胫钩额螽与疑钩额螽、斑翅草螽聚为一支，与传统分类学的研究结果一致。
（2）转录组研究结果：黑胫钩额螽雌、雄成虫分别获得了54,968,554条和53,645,136条clean reads，雌、雄成虫的GC含量分别为44.75%和45.85%。其中，雌性成虫获得的147,380个contig，总长度35,181,115bp，N50为299；雄性成虫则获得了162,240个contig，总长度38,282,436bp，N50为296，且最终获得了61,779个All-Unigene。此外本研究总共预测出26,240条CDS。综合所有的数据库注释结果得出：Nr中有22,934条，Nt中有8,504条，Swiss-Prot中有16,915条，KEGG中有14,854条，COG中有6,598条，GO数据库中有8,478条，总计共有24,025个Unigene获得了蛋白功能注释，占到了所有Unigene的38.89%。分类统计结果显示：注释到COG数据库中的6,598个Unigene共涉及25个功能；注释到GO数据库中的8,478个Unigene分别在三个本体（基因的分子功能、细胞组分、参与的生物过程）中获得了10,823条、18,557条、33,206条注释，且这三个本体的功能类别分别有16个、18个、23个；注释到KEGG数据库中的14,854个Unigene共参与了258条pathway，按照KEGG的分类原则这258条pathway可統分为6大类。注释到Nr数据库中的22,934个Unigene中，注释匹配度达到80%以上的Unigene约有11.9%。除此之外，黑胫钩额螽雌性成虫中检测出了47,203个SNP；黑胫钩额螽雄性成虫中检测出了49,651个SNP。同时本研究检测出了2,684条SSR，其中三聚体SSR的含量最高。
（3）Unigene差异表达分析结果：黑胫钩额螽的差异表达基因有9,937条，其中，雄性个体中表达较丰富的基因有3,820条，雌性个体中表达较丰富的基因有6,167条。其差异基因注释到GO数据库中的数目为1,348个，比列占到了13.50%，其在细胞组分、分子功能、参与的生物学过程三个本体中显著性富集的GO条目数依次是24个、26个、24个。而其差异基因匹配到Pathway中的共有2,320个，且匹配到Pathway的条目数有245条。
（4）线粒体转录组作图分析结果：黑胫钩额螽的线粒体基因组上总共有14,458个位点获得了reads覆盖度。其中，黑胫钩额螽雄性成虫的线粒体基因组中各基因的碱基覆盖度要高于雌性成虫。蛋白编码基因中COI在雌、雄成虫中的表达水平均是最高的，而表达水平最低的则分别是ND6和ATP8。此外J链上的编码基因的reads覆盖度往往高于N链上的编码基因，表明两者均各自存在多个转录起点。黑胫钩额螽雄性成虫线粒体转录组中rRNA的reads覆盖度要高于雌性成虫。此外LrRNA的reads覆盖度也要远大于SrRNA，其中，LrRNA碱基位点平均覆盖度为28,558，SrRNA的碱基位点平均覆盖度为2,572，说明大亚基在核糖体的组装中发挥着更为重要的作用。
本课题作为黄原教授主持的国家自然基金项目“直翅目昆虫的比较及进化线粒体转录组学研究”的重要组成部分，也是目前首次对黑胫钩额螽的线粒体基因组及其转录组所进行的研究，为螽亚目昆虫的研究提供了又一种重要的转录组数据。