● 摘要
本研究克隆了中国林蛙（Rana Chensinensis）Dmrt1 (double-sex and mab-3 related transcription factor 1)基因，并检测了该基因在中国林蛙成体不同组织的表达以及在精巢中的定位。然后，将林蛙暴露于不同浓度的辛基酚（octylphenol，OP，10-8,10-7,10-6,10-5mol/L）后，检测精巢中Dmrt1 mRNA 的表达变化，探讨OP对Dmrt1基因表达的影响，分析Dmrt1可能的生理功能。采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和cDNA拼接技术，克隆中国林蛙Dmrt1基因，对其所编码的氨基酸序列信息，进化关系，蛋白质理化性质,二三级结构,亲水/疏水性，跨膜结构，信号肽，细胞定位进行分析。通过RT-PCR分析Dmrt1在成体精巢、卵巢、肝脏、肾脏和脑组织中的分布；对幼体性腺中肾复合体（GMC）中Dmrt1的表达变化也用RT-PCR进行分析；雌雄基因组中Dmrt1水平的差异用PCR技术进行简单评估。用荧光实时定量PCR检测不同OP浓度和不同暴露时间对Dmrt1 mRNA表达的影响；用原位杂交技术检测Dmrt1 mRNA在精巢中的位置。主要实验结果和结论如下：
中国林蛙的Dmrt1 cDNA全长1118 bp，其中1005 bp的开放阅读框可编码334个氨基酸。与其它脊椎动物的Dmrt1氨基酸序列比对，中国林蛙的Dmrt1序列与粗皮蛙的相似性为97%，与黑斑侧褶蛙为95%，具有很高的相似性。其中DM保守域、雄性特定域和P/S域相似度也很高。
中国林蛙的Dmrt1蛋白一级结构分析显示，相对分子量为36750.0Da，理论等电点PI为8.45，酸性氨基酸（Asp+Glu）28个，碱性氨基酸（Lys+Asp+His） 39个，分子式为C1582H2467N451O513S23，消光系数为40340，半衰期为30h，不稳定系数为61.89，脂肪族指数和亲水性平均系数分别为52.57和-0.656。二级结构分析显示，该蛋白是包含α-螺旋，无规卷曲和延伸链的混合型蛋白。三级结构分析结果显示与该蛋白质最匹配的模板是1lpvA，最佳比对区域位于Dmrt1蛋白序列的第26-74位氨基酸残基，序列一致性达64%，e值为5.84e-12,该蛋白质DM域包含一个锌指结构。亲水疏水性分析，跨膜分析，信号肽分析和细胞定位分析显示该蛋白属于亲水性蛋白质（与理化性质分析结果一致），无跨膜区，且其有可能是位于线粒体细胞核的DNA结合蛋白（非组蛋白）。
RT-PCR结果显示，Dmrt1仅在雄性成体的精巢和肾脏中表达，且精巢中Dmrt1表达量比肾脏高。中国林蛙雌、雄两性的基因组中Dmrt1基因拷贝数基本一致，表明Dmrt1基因在雌雄中国林蛙基因组中不具性别二态性。
Dmrt1在G30-G36期中国林蛙蝌蚪的性腺中肾复合体（gonad-mesonephros complex, GMC）中被检测到，此后在蝌蚪未被检测到。表明Dmrt1可能在性腺分化中起重要作用。
原位杂交结果显示，雄性成体的Dmrt1 mRNA主要定位于精巢间质细胞，支持细胞和部分生精细胞。
将林蛙暴露于不同浓度的OP水体后，用qRT-PCR检测Dmrt1 mRNA 在精巢中的表达。与空白组相比，在暴露10d，除10-8 mol/l OP组外，各OP处理组的Dmrt1 mRNA显著下降（p
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