● 摘要
恶性肿瘤的发病率在全球范围内呈现不断上升趋势，已成为人类主要的死亡病因之一。建立简单、灵敏、特异和快速的生物标示物检测方法，对疾病的预防、诊断和治疗具有十分重要的意义。电化学发光(Electrogenerated chemiluminescence，ECL) 是在电极上施加一定的电压使电极反应产物之间或电极反应产物与溶液中某组分进行化学反应而产生的一种光辐射。由于其灵敏度高，检测范围宽，装置简单等优点，电化学发光分析法在生物分子的检测及疾病的诊断等方面应用比较广泛。电化学发光生物传感器是将特异性分子识别物质如酶、抗原/抗体、肽、DNA、糖等作为分子识别物质固定在换能器上，以电化学发光信号为检测信号的分析器件，在分析化学的研究领域中起着越来越重要的地位。将多肽作为分子识别物质，与蛋白质相比，它具有分子量小、易于化学合成、价格低廉，并且具有高的亲和性，极强的生物活性，可在极端条件下使用等优点，在生物标示物的检测中得到人们的关注。
本论文提出电化学发光肽生物传感器信号放大策略的研究，以肽为分子识别物质，电化学发光试剂为信号物质，分别以金纳米粒子和DNA为电极修饰材料和信号物质载体，构建高灵敏度电化学发光肽生物传感器，将其应用于生物标示物的分析检测。探索研究具有新颖特性的肽电化学发光探针的合成和分离方法；研究基于纳米材料和核酸杂交的信号增强作用的不同信号放大策略；建立高灵敏度测定肌钙蛋白和前列腺特异性抗原的分析新方法。
本论文由引言和研究报告两部分组成。第一部分为引言，简单介绍了电化学发光的定义和特点，综述了基于纳米粒子信号放大和分子生物学二维放大信号的电化学发光法在检测生物标示物中的应用；最后提出本论文的研究目的和研究内容。
第二部分为研究报告部分，由以下三部分组成：
一、基于二茂铁淬灭钌衍生物电化学发光肽生物传感器检测前列腺特异性抗原 以特异性多肽为分子识别物质，结合二茂铁标记的多肽对信号物质钌联吡啶-TPA电化学发光的淬灭作用和金纳米的信号放大作用，建立了一种高灵敏检测前列腺特异性抗原(PSA)的电化学发光分析方法。将钌联吡啶吸附在掺杂金纳米粒子的Nafion膜修饰玻碳电极上，再将二茂铁标记的多肽自组装于金纳米粒子表面，构建了低背景的传感器；当存在检测物PSA时，PSA选择性地切断二茂铁标记的多肽，被切断的二茂铁多肽片段离开电极表面，电化学发光增强，增加的电化学发光强度与PSA浓度的对数在5.0×10-12 g/mL～5.0×10-9 g/mL内呈良好的线性关系。检出限为0.8pg/mL。该方法具有灵敏度高，重现性好等优点。该工作建立的抗原对多肽选择性切割和高灵敏度电化学发光检测相结合的策略为超高灵敏度检测蛋白质提供了一条新思路。
二、基于金纳米粒子作为载体信号放大的电化学发光肽传感器检测心肌肌钙蛋白I 以肽FYSHSFHENWPS作为分子识别物质，结合纳米粒子的放大作用，建立高灵敏度的电化学发光分析方法检测目标蛋白cTnI。电化学发光信号物质钌联吡啶衍生物Ru(bpy)32+与功能化的金纳米粒子通过静电作用形成聚合物Ru(bpy)32+-AuNPs，再经金硫键将探针肽CFYSHSFHENWPS的C端自组装在Ru(bpy)32+-AuNPs上，形成电化学发光探针。通过巯基自组装将捕获肽CFYSHSFHENWPS 固定在金电极表面，制得传感器；该传感器与目标蛋白结合后，再与电化学发光探针结合，利用夹心法进行肌钙蛋白的电化学发光检测。电化学发光强度与肌钙蛋白浓度的对数在3.0×10-12 g/mL ~ 7.0×10-11 g/mL之间呈良好的线性关系。引入的金纳米粒子由于其良好的导电性，大的表面积以及良好的生物相容性，为信号物质多负载与肽的多位点结合提供场所，大大提高了肌钙蛋白的检出范围降低了检出限，检出限为0.5 pg/mL。
三、基于核酸超夹心信号放大的电化学发光分析法检测心肌肌钙蛋白I 以DNA为信号物质载体，特异性肽CFYSHSFHENWPS为分子识别物质，利用DNA的杂交作用形成携带信号物质的电化学发光探针，构建了一种二维信号放大式电化学发光肽传感器，建立了简单、高灵敏度检测心肌肌钙蛋白I的电化学发光分析法。由于DNA的杂交作用提高了信号物质钌联吡啶的负载量，进一步提高检测的灵敏度。电化学发光值与肌钙蛋白浓度的对数在5.0×10-13 g/mL ~ 5.0×10-11 g/mL范围内呈良好的线性相关，检测限为0.14 pg/mL。
本论文以肽为分子识别物质，将心肌肌钙蛋白I和前列腺特异性抗原作为目标分析物，基于纳米材料多负载信号放大和DNA超夹心信号放大作用，构建了三种灵敏的电化学肽生物传感器，建立了高灵敏度检测心肌肌钙蛋白I和前列腺特异性抗原的电化学发光分析方法。该为临床疾病的早期诊断和治疗提供具有潜在应用价值的分析方法和器件，对生物传感器和生命科学的发展具有重要意义。