● 摘要
摘 要
?棉花是锦葵科棉属植物的种子纤维，原产于亚热带，是世界上最主要的经济作物之一。棉花基因组测序目前已经完成，对棉花中功能基因的研究也进入到更深更广的阶段。为了更好的研究棉花基因的功能，需要利用转基因的方法进行基因功能分析，但棉花的遗传转化实验周期长，需要耗费大量的人力、物力，并且转化率低。而用瞬时转化技术可方便、快速的验证启动子活性，蛋白质与蛋白质互作，亚细胞定位等，有助于快速分析棉花来源的基因功能。
本文选择棉花子叶作为实验材料，利用GUS表达载体及农杆菌注射的方法建立了棉花子叶瞬时表达系统；通过正交实验对转化的农杆菌菌株、注射菌液浓度、共培养天数、苗龄和注射量进行了优化。在此基础上利用棉花子叶瞬时表达系统对棉花中克隆的诱导型启动子D-7的活性进行了分析，对Ghppr1和GhpprH2的亚细胞定位进行了研究，取得的结果如下：
1、利用棉花子叶作为实验材料，通过农杆菌介导的方法将含gus基因的表达载体注射到子叶中，检测GUS表达。正交实验得到的结果显示：萌发6天的棉花子叶注射50µl OD600为0.5的含gus基因的农杆菌，共培养2-3天后，外源基因表达效率最高。
2、棉花子叶比真叶更适合做外源基因的瞬时表达研究，农杆菌LBA4404介导的转化效果优于GV3101。此方法从棉花萌发到结果观测，仅需8—12天时间，且操作简单易行，在棉花基因功能的研究方面有较好的应用价值。
3、以eGFP为报告基因，利用棉花子叶瞬时表达系统对D-7启动子活性进行分析，结果显示D-7启动子是一个弱的胁迫诱导型启动子，受干旱、盐、ABA、高温、低温处理6-9h时，有绿色荧光表达，与D-7-eGFP转化拟南芥的实验结果有一致性。表明棉花子叶瞬时表达系统可用于棉花来源的启动子活性研究，强启动子的效果更宜于观察检测。
4、生物信息学分析显示GhPPR1基因可能有细胞核定位信号。利用PCR方法从Ghppr1扩增得到一段长度为1875bp的基因序列，命名为Ghppr1-p。利用pEASYTM-T5 Zero、PZP211和Ghppr7spE载体，构建了CaMV35S启动子驱动的Ghppr1-p与eGFP融合的植物表达载体，命名为Ghppr1-eGFP。
?5、以eGFP为报告基因，利用棉花子叶瞬时表达系统及激光共聚焦显微镜观察Ghppr1和GhpprH2的亚细胞定位。结果显示：子叶注射了含GhpprH2-eGFP载体的农杆菌LBA4404，共培养3天后，在叶绿体中可观察到显著的绿色荧光，表明GhpprH2定位于叶绿体。