● 摘要
血栓与出血性疾病严重威胁着人们的健康，而且，随着人们生活水平的提高，中风、心肌梗死等与血小板相关的血栓性疾病的发病率也呈不断上升的趋势。当血管内皮细胞受到损伤或高剪切力条件下，血小板膜糖蛋白（Glycoprotein，GP）Ib-IX复合物与血管内皮表面（或血浆中）的血管性血友病因子（von Willebrand Factor，VWF）的结合使得血小板粘附在损伤处并启动内部的信号转导途径，使得血小板表面另一受体GPIIb-IIIa（αIIbβ3）活化，最终导致血小板相互聚集成团，形成血栓。GPIb-IX复合物由GPIbα，GPIbβ，GP Ib和GPV组成。GPIbα的胞外区含有VWF结合的功能区，其胞内区含有信号分子14-3-3ζ和肌动蛋白结合蛋白（Actin Binding Protein，ABP，也被称为Filamin A）的结合位点。GPIbα Ser609和GPIbα Ser587/590位置磷酸化的丝氨酸都是14-3-3ζ的结合点，采用穿膜多肽技术阻止14-3-3ζ与GPIbα Ser609的结合显著抑制了GPIbα的VWF结合功能。GPIbα胞内段557-579区是ABP的结合点，ABP与GPIbα的脱离增强了GPIbα的VWF结合功能。由蛋白激酶A（Protein kinase A，PKA）调控的GPIbβ Ser166位置磷酸化的丝氨酸也是14-3-3ζ的结合点，缺失或突变GPIbβ Ser166显著提高了GPIbα的VWF结合能力。 本文首先验证GPIbα Ser559位置是否是一个14-3-3ζ结合点。本文采用了表达野生型GPIb-IX的中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary cells, CHO）细胞株1b9，同时表达野生型GPIbβ，GP Ib和在 565或551以后氨基酸序列缺失的GPIbα的CHO细胞株Δ565或Δ551。免疫共沉淀和Western blot结果表明Δ565中的GPIbα结合有14-3-3ζ，而Δ551中的GPIbα没有结合14-3-3ζ。Western blot结果表明包被有14-3-3ζ蛋白的Beads结合有Δ565的GPIbα，而包被有14-3-3ζ蛋白的Beads没有结合Δ551的GPIbα。同时本文使用了与GPIbα Ser559附近氨基酸序列一致的穿膜多肽MP-P (C13H27CONH-RGpSLP)，MP (C13H27CONH- RGSLP) 和SMP-P(C13H27CONH-LpSRPG)。Western blot结果表明MP-P剂量依赖的抑制了Δ565中GPIbα与14-3-3ζ的结合。这些结果表明GPIbα Ser559是一个新的14-3-3ζ结合点。本文还利用了同时表达野生型GPIbβ，GP IX和GPIbα Ser559突变为丙氨酸的GPIbα的CHO细胞株S559A，同时表达野生型GPIbα，GP IX和GPIbβ Ser166突变为丙氨酸的GPIbα的CHO细胞株S166A。与1b9相比，流式细胞仪结果表明，S559A中GPIbα的VWF结合能力显著降低（P