题目：外源无机金属离子对氯过氧化物酶催化性能的影响及构效关系研究

酶催化反应由于其具有条件温和、高效定向、环境友好等特点如今已被广泛应用于有机合成、药物制备等领域，被视为今后大宗化学品绿色合成的重要手段，对实现可持续发展战略具有重要意义。然而目前普遍存在的酶的稳定性与工业生产所需的高温、强酸、强碱等苛刻条件之间的矛盾是制约酶的大规模产业化应用的一个瓶颈。
筛选有效的小分子添加剂用于改善酶的催化活性以及提高其稳定是本人所在课题组近年来的一个研究方向。本论文在已有研究结果基础上，将研究内容定位在考察无机金属离子对酶催化性能的影响，选用被认为是血红素过氧化物酶家族中催化活性最广泛的酶——氯过氧化物酶（chloroperoxidase, 简称CPO）为性能改造的目标酶，系统研究了元素周期表中具有代表性的22种金属离子的作用，主要结果如下：
1. 所考察的22种金属离子M+ (Li+, Na+, K+, Rb+, Cs+, Ag+)、M2+ (Zn2+, Ni2+, Cu2+, Cd2+, Mn2+, Ca2+, Mg2+, Co2+, Hg2+, Pb2+) 和 M3+ (Cr3+, La3+, Fe3+, Ce3+, Y3+, Al3+)对CPO的催化活性均呈现“低促高抑”现象，痕量金属离子（1×10-6-2×10-5 mol·L）具有激活作用，这种激活作用与金属电荷及金属离子浓度呈现相关性，其中M3+激活效果最好。在金属离子最佳浓度时，CPO催化MCD（2-氯-5,5-二甲基-1, 3-环己二酮）氯化活性可提高17.4%-26.4%；50ºC时，在Li+, Zn2+和Cr3+三种金属离子与CPO温育2h 后，CPO的残余活性比游离酶40%分别提高了22%，35%和40%。金属离子存在时，基于CPO紫外特征吸收、内源性荧光及圆二色光谱分析考察了酶蛋白活性中心微环境及二级结构的变化，以期阐明这种激活作用的结构基础。结果表明，CPO活性中心卟啉环的暴露程度增加，有利于底物接近，促使其活性提高；而α-螺旋结构的增强则改善了CPO对高温等致失活因素的抵抗性能。
2. 基于金属离子的激活作用，进一步考察了其对CPO的结构修饰作用。CPO晶体结构预测在血红素活性中心附近存在一个Mn2+的位点，本文通过EDTA配位竞争移除Mn2+，以石墨炉原子吸收检测直接证实了Mn2+的存在，并考察了移除前后CPO的催化活性及结构变化；然后进一步以激活效应较好的Cr3+、Zn2+和Ca2+替代Mn2+，同时考察了修饰酶CPO的各项酶学性能。
3. 本文还基于酸性介质中硫酸高铈(IV)对酶蛋白分子肽链上荧光发色团色氨酸和酪氨酸残基的氧化，通过强化共轭体系效应增敏酶蛋白的分子荧光而建立了一种微量氯过氧化物酶的分析方法；该方法在8.53×10-7- 4.90×10-6 mol•L-1范围内呈良好的线性关系，检出限可达6.83×10-7 mol•L-1。与经典的基于Soret吸收的紫外光谱分析法相比，检测灵敏度大为提高，相对标准偏差小于1.0%。
本文结论对于金属离子作为修饰剂改善和调控其他酶的催化性能同样具有指导价值。