● 摘要
蚯蚓是我国的一种重要中药材，其中含有多种生物活性成分，抗氧化酶的含量尤为丰富。蚯蚓中所含的抗氧化酶主要有过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶及谷胱甘肽转硫酶等。抗氧化酶具有重要的生理功能，它们可清除体内的氧自由基，防止机体受到氧化损伤。因此，从蚯蚓体内提取纯化抗氧化酶对于提高蚯蚓的综合利用价值，以及拓宽抗氧化酶的来源具有重要意义。
本研究首次将闪式提取这一新型提取技术应用于过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶及谷胱甘肽转硫酶的提取分离。闪式提取法具有高效、快速、节约能源及无需加热等优点，不会破坏生物活性物质。本研究利用闪式提取法、DEAE-Cellulose离子交换色谱及Sephadex G-75凝胶过滤色谱对蚯蚓中的过氧化物酶进行了分离纯化。此外，本研究利用闪式提取与超声提取相结合的方法从蚯蚓中提取了谷胱甘肽还原酶，并利用丙酮沉淀、硫酸铵沉淀以及DEAE-Sepharose琼脂糖凝胶层析柱对蚯蚓谷胱甘肽还原酶进行了纯化。同时，本研究对过氧化物酶及谷胱甘肽还原酶的提取方法进行了优化，并对两种酶的酶学性质进行了研究。另外，本研究成功利用闪提法从蚯蚓中提取了谷胱甘肽转硫酶，并利用CDNB法测定了所提取的谷胱甘肽转硫酶的总活力。
结果表明，利用正交试验优化过氧化物酶的提取工艺，确定的闪提最优条件为：料液比为1:1，pH值为8.0，闪提时间为35 s。纯化后过氧化物酶比活力达到了783.3 U/mg，回收率为27.8%。过氧化物酶分子量大小为35 kDa，最适pH值为6.0，最适温度为65 ℃。谷胱甘肽还原酶的最佳提取条件为：pH值7.5，料液比1:5，闪提时间45 s，超声时间15 min。提取的谷胱甘肽还原酶比活力达到655.9 U/mg，纯化了32.3倍，回收率为58.4%。谷胱甘肽还原酶的分子量为110 kDa，其最适pH值和温度分别为8.0和50 ℃。谷胱甘肽转硫酶的总活力为112.98 U，比活力为0.083 U/mg。
本研究首次从蚯蚓中提取了过氧化物酶、谷胱甘肽还原酶及谷胱甘肽转硫酶，其中，过氧化物酶及谷胱甘肽还原酶的比活力及回收率均处于较高水平。本研究所确定的提取工艺简便、快捷，适合于工业化生产。