题目：中华虎凤蝶三种群及黄黑纹野螟线粒体基因组序列测定及分析

鳞翅目属昆虫纲第二大目，包括蛾和蝶两类昆虫。鳞翅目昆虫种群数量较大，传统的形态学分类很难对其做出准确的分类界定。随着分子生物学的不断发展以及计算机技术水平的不断提升，线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）的有关数据越来越多的应用于鳞翅目的各研究领域，特别是系统分类学方面。截止2013年10月，NCBI的GenBank数据库共收录鳞翅目全线粒体基因组序列99条，其中蝶类50条，蛾类49条。对于物种繁多的鳞翅目而言，现有的信息还远远不足。
为了进一步丰富鳞翅目昆虫mtDNA数据，以便进一步了解鳞翅目的系统发育关系，本研究采用Sub-PCR技术结合引物步移法分别对中华虎凤蝶Luehdorfia chinensis（Leech，1893）（宁陕（即，周氏虎凤蝶 Luehdorfia choui Shou et Yuan）、华阴和周至）三种群以及黄黑纹野螟Tyspanodes hypsalis（Warren, 1891）的线粒体基因组全序列进行测定、拼接、注释和分析。并结合GenBank数据库中已有的鳞翅目全线粒体基因组数据，基于PCGs、rRNAs及PCGs & rRNAs三个数据集，以冈比亚按蚊和黑腹果蝇为外群，利用最大似然法、最大简约法和贝叶斯法原理，重新构建鳞翅目昆虫间的系统发育关系。主要结论如下：
1. 线粒体基因组的基因组成及排列
中华虎凤蝶华阴种群线粒体基因组全长16028 bp，周至种群15580 bp，宁陕种群15580 bp及黄黑纹野螟15329 bp。所测线粒体基因组组成与结构同已知的鳞翅目昆虫一致，即13个蛋白质编码基因、2个rRNA编码基因、22个tRNA编码基因和一个A+T富集区。
所测昆虫mtDNA排列紧密，四种线粒体基因组都分别存在重叠区和间隔区。中华虎凤蝶华阴种群mtDNA中存在重叠区8处，总长度为26 bp，除A+T富集区外，存在间隔区18处，总长度为193 bp；周至种群mtDNA中存在重叠区9处，共28 bp，间隔区18处，长度为193 bp；宁陕种群mtDNA内存在重叠区9处，共28 bp，间隔区18处，共192 bp。黄黑纹野螟线粒体DNA存在间隔区14处，共180 bp，重叠区9处，共26 bp。
中华虎凤蝶三种群及黄黑纹野螟线粒体基因组的碱基组成均具有明显的AT偏向性，全基因组（J链）AT含量分别为：中华虎凤蝶华阴种群81.9％，周至种群81.4％，宁陕种群81.6％，黄黑纹野螟81.42％；各个基因碱基组成：tRNAs、PCGs、rRNAs以及A+T富集区也都有很强的AT偏向性。
中华虎凤蝶三种群及黄黑纹野螟mtDNA的13个蛋白编码基因中，COI基因以CGA为起始密码子，其他蛋白编码基因均以ATN为起始密码子。三种群终止密码子的使用情况为：COI和COII基因为不完全密码子T，剩余11个蛋白基因均以完整的TAA行使终止密码子功能。黄黑纹野螟的COII基因以T为终止密码子，ND5以TA为终止密码子，ND1以TAG为终止密码子，其余蛋白基因以TAA为终止密码子。
中华虎凤蝶三种群和黄黑纹野螟线粒体基因组中的tRNA二级结构存在一定的碱基错配，并以G-U为主。四种全线粒体基因中除tRNASer(AGN))基因外，所有tRNA均可形成典型的三叶草形二级结构。
中华虎凤蝶三种群及黄黑纹野螟的非编码区都位于srRNA基因和tRNAMet基因之间，全长分别为：中华虎凤蝶华阴种群1095 bp，周至种群646 bp，宁陕种群648 bp，黄黑纹野螟350 bp。在中华虎凤蝶三种群的该区域发现普遍存在于鳞翅目昆虫中的一些保守元件和串联重复结构，而在黄黑纹野螟的A+T富集区发现保守基序及微卫星结构。
2. 鳞翅目线粒体基因组基因组成及排列比较
中华虎凤蝶三种群及黄黑纹野螟的基因排序均与已知的50种蝶类和49种蛾类的线粒体基因组一致，但与较原始的种类，如云南无钩蝠蛾（Ahamus yunnanensis (Yang, Li et Shen, 1992）和人支蝠蛾（Thitarodes renzhiensis (Yang, 1991)）线粒体基因组的排列相比发生了易位。即，由原来的tRNAIle-tRNAGln-tRNAMet发展进化为到现在的tRNAMet-tRNAIle-tRNAGln。
3. 鳞翅目系统发育关系分析
分别以13个蛋白编码基因（PCGs）、2个rRNA基因（srRNA和lrRNA）以及PCGs & rRNAs核酸序列构建三个数据集，并利用贝叶斯推理法（BI）、最大似然法（ML）和最大简约法（MP）三种方法，共构建9种发育树。分析建树结果得出以下结论：1）弄蝶总科（Hesperoidea）是位于凤蝶总科（Papilionoidea）内部的一个分支，这与传统分类将凤蝶总科与弄蝶总科归为姐妹群并不相符；2）在蛾类的系统关系中，夜蛾总科（Noctuoidea）、蚕蛾总科（Bombycoidea）及尺蛾总科（Geometroidea）的关系较近。卷蛾总科（Tortricoidea）、巢蛾总科（Tineoidea）与其他蛾类的系统发育关系难以形成稳定的支系。3）关于本研究的中华虎凤蝶三种群的系统分类关系，建树结果并不支持将周氏虎凤蝶单独划分为一个物种，而是更倾向周氏虎凤蝶归于中华虎凤蝶的一个种群即中华虎凤蝶宁陕种群。