题目：四种酚类化合物对溶菌酶淀粉样纤维化的抑制作用

截止目前，已经确定20多种由蛋白质或多肽的淀粉样纤维化沉积有关的人类疾病，如老年痴呆症、疯牛病、溶菌酶淀粉样变性疾病、帕金森综合症、家族性血管淀粉样变性、Ⅱ型糖尿病等等。我们把这些疾病定义为淀粉样变性疾病。这些疾病是由于正常的本来可溶于血浆的蛋白转变成为不溶的淀粉样纤维形态从而沉积于细胞外造成的，这些纤维样聚集体被称之为淀粉样纤维。这些淀粉样纤维几乎可以对人体所有的器官都会产生影响，这也是临床诊断和治疗面临的一个重要挑战。迄今为止人们已经发现至少有36种蛋白质能发生淀粉样沉积，它们通过一定的方式引发人类疾病。这些病症严重影响着人类的心血管系统、泌尿系统、神经系统的正常运行等等。
本实验是将鸡蛋清溶菌酶溶解在pH 2.0的HCl溶液中，将其浓度定为10 mg/ml，所加的抑制剂苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚和对苯醌的浓度均定为100 μg/ml，放入65 ℃的恒温箱中孵育15天，将所得的样品进行各种实验：研究溶菌酶分子在淀粉样纤维化过程中的构象变化，如α-螺旋﹑β-折叠﹑疏水区的变化趋势等，以苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚和对苯醌作为抑制剂，探究其分别对溶菌酶淀粉样纤维化的作用及其机理。

实验主要方法和结果：
1.   检测溶菌酶淀粉样纤维的生长
本实验中检测溶菌酶在淀粉样纤维化过程中的生长情况和构象的各种变化情况主要采用荧光探针技术和圆二色谱技术。如用ThT荧光探针技术和圆二色谱检测a-螺旋、β折叠，用ANS荧光检测表面疏水区改变情况等。ThT荧光探针技术和圆二色谱技术表明，溶菌酶在纤维生长过程中，主要伴随着α-螺旋的减少和β-折叠的增加；同时，ANS荧光曲线表明在此过程中还伴随着疏水区域的逐渐暴露等，这些实验现象都表明溶菌酶淀粉样纤维化具有成核-延伸-形成纤维的动力学特征。

2.   酚类化合物对溶菌酶淀粉样纤维化的影响
将苯酚、邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚和对苯醌的终浓度均为100 μg/ml的溶菌酶混合液在65 ℃水浴锅中恒温孵育后，同样采用采用ThT、和圆二色谱技术检测溶菌酶在淀粉样纤维化过程中的二级结构的变化。ANS荧光检测溶菌酶表面疏水区域的暴露情况，结果表明，苯酚和间苯二酚对溶菌酶淀粉样纤维化没有明显的作用，而邻苯二酚和对苯二酚对溶菌酶淀粉样纤维化有明显的抑制作用。

3.   溶菌酶纤维的形态检测
检测溶菌酶纤维的形态主要由两种方法：偏振光显微镜和透射电子显微镜[12]。在偏振光显微镜下，观察到的溶菌酶纤维具有淡亮黄色，是由原纤维组成的没有分支的条状结构[6][11]；而在透射电镜下，可观察到网状和丝状纤维结构。在有酚类化合物，苯酚、邻苯二酚、间苯二酚和对苯二酚作为抑制剂存在时，溶菌酶纤维的形态会有所改变。

4.   溶血试验检测溶菌酶纤维对红血细胞的毒性
通过分别对加不同酚类化合物的溶菌酶淀粉样纤维来检测其分别对红血细胞的毒性作用检测，实验结果表明，加入领苯二酚和对苯二酚的溶菌酶淀粉样纤维对红细胞的影响偏大，而加入苯酚和间苯二酚的溶菌酶淀粉样纤维对红血细胞的毒性比较小。

5.   探究邻苯二酚和对苯二酚对溶菌酶纤维化有抑制作用的机理
探究四种酚类化合物对溶菌酶纤维化的作用机理，主要是通过高效液相色谱法，二极管阵列检测的高效液相色谱法和Tricine 体系SDS-PAGE电泳及电转实验来验证的。通过一系列实验结果发现，在所加的四种最简单的酚类化合物中，邻苯二酚和对苯二酚对溶菌酶纤维化有很强的抑制作用，而苯酚和间苯二酚对溶菌酶纤维化的抑制作用不明显，为了探究其原因通过做Tricine 体系SDS-PAGE电泳、电转实验和NBT染色实验，确认这两种邻苯二酚和对苯二酚能够通过形成醌类中间体与溶菌酶形成共价修饰产物而抑制了溶菌酶纤维化。
结论：实验证明，溶菌酶的淀粉样纤维化倾向是随其浓度的增大而逐渐增大的。在所加的酚类化合物中，苯酚和间苯二酚在纤维化过程中，对其没有明显的作用，而邻苯二酚和对苯二酚对其淀粉样纤维化有明显的影响。溶菌酶在纤维化的过程中在α-螺旋减少的同时都伴随着β-折叠增加，以及疏水区域的外露。为了弄清酚类化合物对溶菌酶纤维化有没有作用本实验主要是利用电转和NBT染色实验来证实，最终证实酚类化合物对溶菌酶淀粉样纤维化的作用机理。