● 摘要
摘? 要
随着工业化的发展，环境内分泌干扰物（environmental endocrine disrupting chemicals, EDCs）不断地被释放到环境中，通过饮食、接触等途径进入机体, 对人类及野生生物的生存产生重大影响。辛基酚（octylphenol, OP）是一种重要的酚类环境雌激素，广泛存在于水体、土壤和日常消耗品中，其雌激素活性大约是雌二醇的10-4倍。实验已证明OP可导致精子质量和数量下降，性激素水平和性行为异常，影响雄性生育能力。细胞色素P450c17（CYP17）是类固醇合成途径中的关键酶，在精巢细胞中与睾酮的合成密切相关。有关OP干扰P450c17的研究已有报道，但有关两栖动物水域OP暴露是否影响 P450c17 mRNA和蛋白的表达仍未见报道，本实验通过将雄性中国林蛙（Rana chensinensis）暴露于含OP的水体中，检测精巢Leydig细胞中P450c17 mRNA 和蛋白的表达水平，探讨OP影响类固醇激素合成的机制，为酚类环境污染物的治理提供依据。
? 本实验将雄性中国林蛙暴露于10-6、10-7、10-8mol/L OP中10、20、30和40 d，10-7、10-8 mol/L E2作为阳性对照；取其精巢，用免疫组织化学方法检测P450c17蛋白在Leydig细胞中的表达，用原位杂交和荧光实时定量的方法对CYP17 mRNA进行定位和定量分析，实验结果如下：
1. 从雄性中国林蛙精巢中成功提取总RNA，OD值（260nm/280nm比值）在1.7-2.0之间。成功克隆出300bp的部分CYP17片段（序列号HQ610611），该片段序列与东北林蛙（Rana dybowskii）的相似性为97%，与粗皮蛙（Rana rugosa）的相似性为97%，与光滑爪蟾（Xenopus laevis）的相似性为96%。用所得片段序列设计合成原位杂交探针。
2. 原位杂交实验结果显示，CYP17mRNA阳性反应产物主要存在于Leydig细胞中，Sertoli细胞和生精细胞中也有所表达。免疫组织化学定位检测与原位杂交结果基本一致。
3. 免疫组织化学阳性反应产物的光密度检测显示：暴露10d，与对照组相比，各OP浓度组的P450c17蛋白表达差异不显著（p>0.05）；暴露20、30d，与对照组相比，10-6、10-7mol/L OP组的表达相对值下降显著（p）；10-7、10-8mol/L OP组的表达相对值高于10-6mol/L OP组（p），10-8mol/L OP组与10-7mol/L OP组差异不显著（p>0.05）；暴露40d，与对照组相比，10-6、10-7mol/L OP组的表达相对值下降显著（p），10-8mol/L OP组与10-7mol/L OP组比较，10-7mol/L OP组与10-6mol/L OP组比较，差异均不显著（p>0.05）。
比较同一OP浓度的不同暴露时间，在10-6mol/L OP处理组中，暴露20d的P450c17蛋白表达相对值低于10d，暴露30d低于20d，差异均显著（p）；在10-7mol/L OP处理组中，暴露20d低于10d（p），暴露30d与20d差异不显著（p>0.05）；在10-8mol/L OP处理组中，暴露20d与10d比较，30d与20d比较差异均不显著（p>0.05）。
上述显示，经OP暴露后，P450c17蛋白的表达值可发生下调，且随OP暴露浓度的升高和暴露时间的延长呈下降趋势，呈现出剂量效应和时间延长效应。暴露30d的P450c17蛋白表达值最低，暴露40d，各浓度组之间的表达差异不显著，即剂量效应被时间累积效应所减弱。
4. 荧光实时定量PCR对CYP17 mRNA表达的检测显示：OP暴露10、20d，与对照组相比，各OP浓度组的CYP17 mRNA表达相对值差异极显著（p），其中10-7、10-8mol/L OP组高于10-6mol/L OP组（p），10-8 mol/L OP组与10-7mol/L OP组比较差异不显著（p>0.05）；暴露30、40d，与对照组相比，各OP浓度组的CYP17 mRNA表达相对值差异极显著（p），10-8mol/L OP组与10-7mol/L OP组比较，10-7mol/L OP组与10-6mol/L OP组比较差异均不显著（p>0.05）。
比较同一OP浓度的不同暴露时间，在10-6mol/L OP组，暴露20d，CYP17 mRNA的表达相对值低于10d（p），30d与20d的差异不显著（p>0.05）；在10-7、10-8mol/L OP组，暴露20d与10d比较，暴露30d与20d比较差异均不显著（p>0.05）。
可见OP可下调CYP17 mRNA的表达，而且随OP暴露浓度的升高和暴露时间的延长呈下降趋势，同P450c17蛋白的表达趋势基本一致。但CYP17 mRNA的表达的最低值在暴露20d到30d之间，比P450c17蛋白表达的最低值出现时间偏早。
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关键词：中国林蛙，细胞色素P450c17，辛基酚，间质细胞
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