● 摘要
信使核糖核酸（mRNA）是一种非常重要的生物标识物。癌症本质上是由基因的非正常表达引起的。如果能在单细胞水平对与肿瘤相关的mRNA进行高精度的检测，则能实现对癌症的早期诊断，并且可以及时准确地评估治疗方案的效果。此外，通过mRNA的探测与成像能够丰富和加深人们对细胞新陈代谢的认识。
近年来，基于金纳米颗粒（AuNPs）的新型荧光核酸探针受到了研究人员的广泛关注。然而，目前对AuNPs荧光核酸探针的研究主要集中于金纳米球（AuNSs），采用的检测手段主要为静态荧光强度测试和单光子共聚焦荧光成像，且对AuNP荧光核酸探针的内在物理机制和性能优化鲜有研究。本论文旨在研究AuNP荧光核酸探针在时间分辨荧光光谱检测及双光子荧光寿命成像（FLIM）方面的应用，开发高效率、多功能型纳米核酸探针，为重大疾病的早期诊断和靶向治疗提供新的技术手段。主要研究成果如下：
（1）首次成功制备了基于金纳米棒（AuNR）的新型纳米信标并应用于肿瘤细胞mRNA的检测成像。我们通过液相转移配体交换法首次成功在AuNR表面修饰荧光标记的发夹型DNA（hpDNA），制备了AuNR纳米信标，并且纳米信标的hpDNA装载量可通过改变反应溶液中hpDNA和AuNR的摩尔浓度比进行调节。荧光强度光谱测试表明，具有较大hpDNA装载量的纳米信标在核酸探测灵敏度、荧光强度响应速度及有效探测浓度范围等方面均优于hpDNA装载量较小的纳米信标。此外，hpDNA装载密度较高的纳米信标能够捕捉较多的目标分子，但纳米信标的杂交效率与其hpDNA装载量呈反向相关性。时间分辨荧光光谱测试深入揭示了纳米信标杂交过程的荧光寿命变化，为研究AuNR和荧光染料分子之间的能量转移过程提供了新的研究视角和技术手段。细胞实验显示，这种新型的纳米信标能够有效地进入肿瘤细胞，且在双光子荧光成像尤其是双光子荧光寿命成像方面具有比单光子共聚焦荧光成像更加优异的性能。
（2）研究了hpDNA的茎干设计对纳米信标响应动力学和检测性能的影响，以及AuNP对荧光染料分子Cy5的猝灭效率随二者间距的变化规律，并展示了AuNP纳米信标在单光子共聚焦荧光成像和双光子FLIM分析方面的应用。结果显示，减少hpDNA间隔区序列能够有效降低纳米信标的背景荧光强度，从而提高纳米信标的信噪比。荧光寿命分析发现，纳米金属表面能量转移（NSET）模型低估了尺寸为13 nm的AuNPs对Cy5的荧光猝灭能力，而电动力学模型的拟合结果与实验结果更加吻合。另外，我们首次采用动态时间分辨荧光光谱技术对具有不同茎干结构hpDNA的纳米信标的杂交反应动力学过程进行了研究，揭示了hpDNA探针设计对纳米信标检测性能的影响，同时也展示了该技术在实时监测纳米信标杂交动力学过程中的荧光强度和荧光寿命变化方面具有重要的应用潜力。细胞实验显示，纳米信标能够有效区分健康细胞和肿瘤细胞，在单光子共聚焦荧光成像及双光子FLIM分析方面均表现出良好的检测效果。
此外，由于局域表面等离激元共振（LSPS）效应，银纳米棒阵列的表面增强拉曼散射（SERS）增强因子高达108，能够同时快速检测并区分多种人体病原体，在生物医学方面有很高的应用价值。我们通过离散偶极子近似法（DDA）系统研究了纳米棒的形状、尺寸、空间排布，以及激发光波长、入射角度、偏振方向等因素对二维六方排布银纳米棒阵列SERS活性衬底电磁增强因子（EF）的影响。结果显示，纳米棒阵列相邻纳米棒的间隙中形成的电磁场“热点”对其SERS电磁增强能力具有决定性影响。虽然增加纳米棒的长度能产生更多的电磁场“热点”，但并不一定提高纳米棒阵列的EF。随着纳米棒长度的增加，常用激发光波长对纳米棒阵列EF的影响逐渐趋于一致。此外，阵列的最大EF在激发光入射方向与衬底法线成一定夹角时获得。当横向平均间隔相同时，随机阵列的平均EF高于有序阵列情形，且间隔标准差越大，平均EF越大。研究结果还显示，尽管缩小阵列横向周期能够使EF单调增加，但EF随阵列对角周期/纵向周期呈波动变化特征，为二维阵列SERS活性衬底性能的优化提供了新的思路。此外，研究结果表明，吸收谱（而不是散射谱或消光谱）可以作为电磁增强性能的一个重要指示参数。这些结果为贵金属纳米棒阵列SERS活性衬底的优化设计及其生物分子检测提供了有益的指导。