● 摘要
正常情况下，植物体内活性氧的产生和清除是一个动态的平衡过程，少量的活性氧可作为逆境下信号分子参与植物的生理过程，大量的活性氧会对植物造成蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重氧化损伤。植物在生长发育过程中时常会受到不良环境的胁迫，如盐渍、干旱、低温等，其中盐胁迫严重影响植物的生长。植物在环境胁迫下体内会产生大量的活性氧，必须及时清除，为了减少盐分等胁迫造成的氧化损伤，植物在长期的进化过程中，形成了一套活性氧的清除保护机制，即植物体内有效清除活性氧的酶促和非酶促系统。酶促系统主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化酶(GPX)等；非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸(ASA)、还原型谷胱甘肽(GSH)等。对植物体内抗氧化保护酶基因的认识有助于研究植物在逆境下的生理状况并保护植物。
本课题以丹参为研究对象，克隆了丹参抗坏血酸过氧化酶基因(SmAPX)和丹参谷胱甘肽过氧化酶基因(SmGPX)。利用生物信息学工具分析了两个基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列特征，并对其酶分子三维立体结构等进行了预测和分析。对它们在丹参体内不同部位的表达以及盐胁迫条件下的表达情况进行了实时荧光定量PCR分析。构建了SmAPX和SmGPX的原核表达载体并对其在大肠杆菌M15中的表达情况进行了分析。主要实验方法和结论如下：
1. 根据丹参EST数据库中的已有序列，电子克隆得到SmAPX基因全长，并通过RT-PCR的方法获得SmAPX的cDNA序列，该基因全长为758 bp，包含一个753 bp的开放读码框，编码250个氨基酸。运用生物信息学工具对丹参APX基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行了分析，结果表明该基因的编码产物是一不具跨膜结构域的亲水性蛋白，定位于细胞质中。实时荧光定量PCR分析显示SmAPX在丹参根、茎、叶中均有表达，但根中表达量最低，茎次之，叶中最高，叶片中的表达量为根中表达量的21倍。对SmAPX基因在盐胁迫条件下的表达情况进行分析，结果显示，随着盐胁迫时间的延长及盐浓度的升高，该基因的表达量均升高。浓度为250 mM的盐溶液胁迫72 h时，SmAPX的表达量为对照的2倍，浓度为200 mM的盐溶液胁迫48 h时，SmAPX表达量最高，比对照高7倍。SmAPX在大肠杆菌M15中表达一分子量约为27kD的蛋白，与预测的蛋白分子量一致，此外，SmAPX基因的表达在一定程度上可提高大肠杆菌的耐盐性。
2. 根据丹参EST数据库中的已有序列，电子克隆得到SmGPX基因全长，并通过RT-PCR的方法获得SmGPX的cDNA序列，该基因全长535 bp，包含一个501 bp的开放读码框，编码166个氨基酸。运用生物信息学工具对SmGPX的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列进行了分析，结果表明该基因的编码产物在翻译后可能在12个位点发生了磷酸化修饰，是一不具跨膜结构域的可溶性细胞质型GPX。从其氨基酸序列所含的两个磷脂氢谷胱甘肽过氧化酶（PHGPX）的特征序列并结合前述研究，推测所克隆到的是GPX家族的一特殊成员，即清除ROS保护生物膜免受氧化损伤的PHGPX。从DNA水平也获得该基因，Southern结果表明SmGPX以低拷贝形式存在于丹参基因组中。实时荧光定量PCR分析显示SmGPX在丹参根、茎、叶中均有表达，根中表达量最低，叶片次之，茎中表达量最高，茎中表达量为根中表达量的6.78倍；盐胁迫处理的丹参植株体内SmGPX的表达量随胁迫时间的延长在实验范围内稳步升高，与对照相比，浓度为250 mM的盐溶液胁迫72 h时SmGPX的表达量升高了2.69倍。SmGPX在大肠杆菌M15中表达出一大约为其理论分子量二倍的蛋白，推测可能是其二聚体形式。